粒细胞样髓源性抑制细胞来源exosomes调节结直肠癌细胞干性的机制研究
发布时间：2022-08-11 17:09
结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一,虽然临床治疗技术的进步提高了疗效,但患者死亡率依然很高。深入研究CRC发生发展机制,寻求新的治疗靶点仍然是重要任务。肿瘤干细胞（Cancer stem cell,CSC）是具有自我更新、多向分化和无限增殖等干细胞特性的细胞群体。基础和临床研究证实了CSC在CRC发生发展中的作用。髓源性抑制细胞（Myeloid derived suppressor cells,MDSC）是骨髓来源的具有免疫抑制能力的异质性细胞群体,其在感染、炎症及恶性肿瘤等病理状态下大量存在。MDSC通过抑制机体抗肿瘤免疫应答、维持肿瘤细胞干性及促进血管形成等多种方式参与肿瘤发生发展。Exosomes（Exo）是直径为30-150 nm的囊泡,携带来源细胞的蛋白质和核酸,在细胞间信息传递中发挥重要作用,参与肿瘤发展的多个环节。目的:本研究探讨粒细胞样MDSC（Granulocytic MDSC,G-MDSC）分泌的 exosomes（GM-Exo）与CRC细胞干性之间的关系,寻找GM-Exo调控CRC细胞干性的关键成分;了解缺氧对G-M...
【文章页数】：149 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词
第一章 绪论
1.1 结直肠癌
1.1.1 散发性结直肠癌
1.1.2 结肠炎相关癌
1.2 肿瘤干细胞与恶性肿瘤
1.2.1 肿瘤干细胞理论
1.2.2 CSC的表面分子
1.2.3 肿瘤干细胞的调控
1.2.4 结直肠癌CSC表型及干预疗效
1.3 MDSC在结直肠癌中的作用
1.3.1 MDSC定义
1.3.2 肿瘤微环境对MDSC的影响
1.3.3 MDSC来源及其免疫抑制功能
1.3.4 MDSC在结直肠癌中的作用
1.4 Exosomes在肿瘤发生发展中的作用
1.4.1 Exosomes的结构
1.4.2 Exosomes的合成与释放
1.4.3 MDSC来源exosomes的特性
1.4.4 Exosomes在肿瘤发生发展中的作用
1.5 S100A9在结直肠癌中的作用
1.5.1 S100A9的结构
1.5.2 S100A9活性调控
1.5.3 S100A9的促炎作用
1.5.4 S100A9在结直肠癌中的作用
1.6 本研究的目的、内容、实验设计及意义
1.6.1 研究目的
1.6.2 研究内容
1.6.3 实验设计
1.6.4 研究意义
第二章 G-MDSC分泌exosomes增强CT-26细胞干性
2.1 实验仪器和材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 实验材料
2.1.3 实验试剂
2.1.4 实验动物
2.1.5 主要溶液配制
2.2 实验方法
2.2.1 CT-26细胞培养
2.2.2 CT-26结直肠癌移植瘤小鼠模型构建
2.2.3 G-MDSC分离纯化
2.2.4 G-MDSC免疫抑制能力检测
2.2.5 GM-Exo制备
2.2.6 GM-Exo蛋白定量
2.2.7 透射电子显微镜观察GM-Exo形态
2.2.8 Westernblot检测GM-Exo相关分子
2.2.9 GM-Exo免疫抑制能力检测
2.2.10 GM-Exo在MDSC促结直肠癌肿瘤干性效应中的作用
2.2.11 GM-Exo在G-MDSC促肿瘤效应中作用观察
2.2.12 GM-Exo促进CT-26细胞成瘤
2.3 结果
2.3.1 CT-26细胞形态
2.3.2 构建CT-26结直肠癌移植瘤模型
2.3.3 磁珠分选出高纯度的荷瘤小鼠脾脏G-MDSC
2.3.4 G-MDSC抑制CD4+T细胞增殖反应
2.3.5 制备GM-Exo并定量
2.3.6 GM-Exo的形态观察
2.3.7 GM-Exo表面CD63和CD9分子检测
2.3.8 GM-Exo具有免疫抑制能力
2.3.9 Rab27asiRNA抑制G-MDSC中Rab27a表达
2.3.10 Rab27a抑制减少GM-Exo释放
2.3.11 Rab27a抑制的G-MDSC促CT-26细胞成球能力下降
2.3.12 Rab27a抑制的G-MDSC促CD44/133表达能力下降
2.3.13 Rab27a抑制的G-MDSC促CT-26细胞移植瘤发生发展的能力下降
2.3.14 GM-Exo被CT-26细胞摄取
2.3.15 GM-Exo增强CT-26细胞成瘤能力
2.4 讨论
第三章 GM-Exo通过S100A9增强CT-26细胞干性
3.1 实验仪器和材料
3.1.1 实验仪器
3.1.2 耗材
3.1.3 试剂
3.1.4 实验动物
3.1.5 主要溶液配制
3.2 实验方法
3.2.1 Westernblot检测GM-Exo中S100A9表达量
3.2.2 转染S100A9siRNA抑制GM-Exo中S100A9表达
3.2.3 G-MDSCexosomalS100A9对结直肠癌细胞CT-26干性特性的影响
3.2.4 流式细胞术检测各处理组CT-26细胞中ROS的表达
3.2.5 Westernblot检测Nox4/p-P65/p-Stat3水平
3.2.6 平板克隆试验观察G-MDSCexosomalS100A9对CT-26细胞增殖的影响
3.2.7 通过移植瘤模型观察GM-Exo携带的S100A9对CT-26移植瘤的影响
3.2.8 细胞迁移实验观察G-MDSCexosomalS100A9对CT-26细胞迁移的作用
3.2.9 G-MDSCexosomalS100A9对CT-26细胞肝转移的影响
3.3 结果
3.3.1 GM-Exo富含S100A9蛋白
3.3.2 S100A9siRNA抑制G-MDSC和GM-Exo中S100A9蛋白表达
3.3.3 GM-Exo呈S100A9依赖性增强CT-26细胞成球能力
3.3.4 GM-Exo呈S100A9依赖性促进结直肠癌细胞表达CD44/CD
3.3.5 GM-Exo呈S100A9依赖性促进CT-26细胞Sox2、Oct4、Nanog及ALDH1A表达
3.3.6 GM-Exo呈S100A9依赖性增加CT-26细胞中ROS水平
3.3.7 GM-Exo呈S100A9依赖性方式促进CT-26细胞Nox4/p-P65/p-Stat3水平
3.3.8 GM-Exo呈S100A9依赖性促进CT-26细胞增殖
3.3.9 GM-Exo呈S100A9依赖性促进肿瘤发展
3.3.10 GM-Exo呈S100A9依赖性促进肿瘤迁移
3.3.11 GM-Exo呈S100A9依赖性促进CT-26细胞肝转移
3.4 讨论
第四章 G-MDSCexosomalS100A9对CAC的作用
4.1 实验仪器和材料
4.1.1 实验仪器
4.1.2 耗材
4.1.3 试剂
4.1.4 实验动物
4.1.5 主要溶液配制
4.2 实验方法
4.2.1 小鼠CAC模型构建
4.2.2 免疫荧光检测GM-Exo在结肠分布
4.2.3 流式细胞术检测GM-Exo在结肠分布
4.2.4 炎症性结直肠癌处理方法
4.2.5 观察指标和标本收集、处理
4.2.6 流式细胞术检测各组织中MDSC-和T细胞亚群
4.2.7 免疫组织化学技术检测结肠局部S100A
4.2.8 H(5)E染色观察结直肠癌组织病理学变化
4.2.9 免疫荧光检测GM-Exo在结肠组织分布
4.2.10 流式细胞计数分析CD133阳性细胞的比例
4.2.11 G-MDSC趋化实验
4.2.12 小鼠CT-26移植瘤模型构建及干预
4.3 结果
4.3.1 构建CAC小鼠模型
4.3.2 外源性GM-Exo易分布至肿瘤局部并且具有累加效果
4.3.3 外源性GM-Exo与肿瘤局部细胞融合
4.3.4 GM-Exo呈S100A9依赖性减轻小鼠体重
4.3.5 GM-Exo呈S100A9依赖性减少CAC小鼠结肠长度
4.3.6 GM-Exo呈S100A9依赖性促进结直肠结节形成
4.3.7 GM-Exo呈S100A9依赖性方式促进结直肠癌进程
4.3.8 GM-Exo呈S100A9依赖性促进结直肠腺瘤形成
4.3.9 结肠组织CD133表达量与GM-Exo分布量呈正相关
4.3.10 GM-Exo呈S100A9依赖性方式增加结直肠组织CD133阳性细胞百分比
4.3.11 肿瘤局部S100A9含量增加
4.3.12 肿瘤局部G-MDSC浸润增多
4.3.13 GM-Exo通过S100A9增加肿瘤局部G-MDSC浸润
4.3.14 GM-Exo依赖于S100A9趋化G-MDSC至外周血和结直肠组织
4.3.15 G-MDS通过S100A9趋化G-MDSC
4.3.16 G-MDSCexosomalS100A9抑制CAC小鼠外周血T细胞数量
4.4 讨论
第五章 缺氧促进G-MDSC分泌exosomes
5.1 实验仪器和材料
5.1.1 实验仪器
5.1.2 耗材
5.1.3 试剂
5.1.4 实验动物
5.1.5 主要溶液配制
5.2 实验方法
5.2.1 脾脏及肿瘤组织来源G-MDSC分泌exosomes能力检测
5.2.2 qRT-PCR检测脾脏及肿瘤来源G-MDSC中HIF-1?和HIF-2?表达量
5.2.3 Westernblot检测G-MDSC中HIF-1?和Rab27a蛋白水平
5.2.4 qRT-PCR检测缺氧和YC-1处理的G-MDSC中HIF-1?表达量
5.2.5 ExoELISA定量G-MDSC分泌的exosoems
5.2.6 Westernblot检测HIF-1?抑制后Rab27a蛋白表达水平
5.3 结果
5.3.1 肿瘤组织来源G-MDSC较脾脏来源G-MDSC分泌exosomes能力增强
5.3.2 肿瘤组织来源G-MDSC较脾脏来源G-MDSC高表达HIF-1?mRNA
5.3.3 缺氧增加脾脏G-MDSC表达HIF-1?和Rab27a蛋白
5.3.4 YC-1抑制G-MDSC中HIF-1?mRNA表达
5.3.5 缺氧呈HIF-1?依赖性促进G-MDSC分泌exosoems
5.3.6 缺氧呈HIF-1?依赖性增强Rab27a蛋白表达
5.4 讨论
第六章 血浆G-MDSCexosomalS100A9在CRC复发中的临床应用
6.1 实验仪器和材料
6.1.1 实验仪器
6.1.2 耗材
6.1.3 试剂
6.1.4 实验动物
6.1.5 主要溶液配制
6.2 实验方法
6.2.1 小鼠血浆exosomes制备
6.2.2 Exosomes定量
6.2.3 Westernblot检测小鼠血浆exosomalS100A9水平
6.2.4 人血浆exosomes制备
6.2.5 流式细胞术分选人血浆CD11b+exosomes
6.2.6 ELISA检测CD11b+exosomes中S100A9含量
6.2.7 ELISA检测人血浆exosomalS100A9含量
6.2.8 CRC患者MDSCexosomalS100A9对SW480干性的作用
6.3 结果
6.3.1 小鼠血浆exosomalS100A9水平检测
6.3.2 FCM检测人血浆CD11b+exosomes负载的胶体颗粒占总颗粒的百比例
6.3.3 ELISA检测血浆CD11b+exosomes和CD11b-exosomes中S100A9含量
6.3.4 ELISA检测人血浆exosomes中S100A9水平
6.3.5 CRC患者肠癌组织M-Exo制备
6.3.6 M-Exo呈S100A9依赖性增强SW480细胞成球能力
6.3.7 CRC患者肿瘤MDSCexosomalS100A9促进SW480移植瘤发生发展
6.4 讨论
结论
参考文献
在学期间发表的学术论文及其他科研成果
致谢
本文编号：3675055
【文章页数】：149 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词
第一章 绪论
1.1 结直肠癌
1.1.1 散发性结直肠癌
1.1.2 结肠炎相关癌
1.2 肿瘤干细胞与恶性肿瘤
1.2.1 肿瘤干细胞理论
1.2.2 CSC的表面分子
1.2.3 肿瘤干细胞的调控
1.2.4 结直肠癌CSC表型及干预疗效
1.3 MDSC在结直肠癌中的作用
1.3.1 MDSC定义
1.3.2 肿瘤微环境对MDSC的影响
1.3.3 MDSC来源及其免疫抑制功能
1.3.4 MDSC在结直肠癌中的作用
1.4 Exosomes在肿瘤发生发展中的作用
1.4.1 Exosomes的结构
1.4.2 Exosomes的合成与释放
1.4.3 MDSC来源exosomes的特性
1.4.4 Exosomes在肿瘤发生发展中的作用
1.5 S100A9在结直肠癌中的作用
1.5.1 S100A9的结构
1.5.2 S100A9活性调控
1.5.3 S100A9的促炎作用
1.5.4 S100A9在结直肠癌中的作用
1.6 本研究的目的、内容、实验设计及意义
1.6.1 研究目的
1.6.2 研究内容
1.6.3 实验设计
1.6.4 研究意义
第二章 G-MDSC分泌exosomes增强CT-26细胞干性
2.1 实验仪器和材料
2.1.1 实验仪器
2.1.2 实验材料
2.1.3 实验试剂
2.1.4 实验动物
2.1.5 主要溶液配制
2.2 实验方法
2.2.1 CT-26细胞培养
2.2.2 CT-26结直肠癌移植瘤小鼠模型构建
2.2.3 G-MDSC分离纯化
2.2.4 G-MDSC免疫抑制能力检测
2.2.5 GM-Exo制备
2.2.6 GM-Exo蛋白定量
2.2.7 透射电子显微镜观察GM-Exo形态
2.2.8 Westernblot检测GM-Exo相关分子
2.2.9 GM-Exo免疫抑制能力检测
2.2.10 GM-Exo在MDSC促结直肠癌肿瘤干性效应中的作用
2.2.11 GM-Exo在G-MDSC促肿瘤效应中作用观察
2.2.12 GM-Exo促进CT-26细胞成瘤
2.3 结果
2.3.1 CT-26细胞形态
2.3.2 构建CT-26结直肠癌移植瘤模型
2.3.3 磁珠分选出高纯度的荷瘤小鼠脾脏G-MDSC
2.3.4 G-MDSC抑制CD4+T细胞增殖反应
2.3.5 制备GM-Exo并定量
2.3.6 GM-Exo的形态观察
2.3.7 GM-Exo表面CD63和CD9分子检测
2.3.8 GM-Exo具有免疫抑制能力
2.3.9 Rab27asiRNA抑制G-MDSC中Rab27a表达
2.3.10 Rab27a抑制减少GM-Exo释放
2.3.11 Rab27a抑制的G-MDSC促CT-26细胞成球能力下降
2.3.12 Rab27a抑制的G-MDSC促CD44/133表达能力下降
2.3.13 Rab27a抑制的G-MDSC促CT-26细胞移植瘤发生发展的能力下降
2.3.14 GM-Exo被CT-26细胞摄取
2.3.15 GM-Exo增强CT-26细胞成瘤能力
2.4 讨论
第三章 GM-Exo通过S100A9增强CT-26细胞干性
3.1 实验仪器和材料
3.1.1 实验仪器
3.1.2 耗材
3.1.3 试剂
3.1.4 实验动物
3.1.5 主要溶液配制
3.2 实验方法
3.2.1 Westernblot检测GM-Exo中S100A9表达量
3.2.2 转染S100A9siRNA抑制GM-Exo中S100A9表达
3.2.3 G-MDSCexosomalS100A9对结直肠癌细胞CT-26干性特性的影响
3.2.4 流式细胞术检测各处理组CT-26细胞中ROS的表达
3.2.5 Westernblot检测Nox4/p-P65/p-Stat3水平
3.2.6 平板克隆试验观察G-MDSCexosomalS100A9对CT-26细胞增殖的影响
3.2.7 通过移植瘤模型观察GM-Exo携带的S100A9对CT-26移植瘤的影响
3.2.8 细胞迁移实验观察G-MDSCexosomalS100A9对CT-26细胞迁移的作用
3.2.9 G-MDSCexosomalS100A9对CT-26细胞肝转移的影响
3.3 结果
3.3.1 GM-Exo富含S100A9蛋白
3.3.2 S100A9siRNA抑制G-MDSC和GM-Exo中S100A9蛋白表达
3.3.3 GM-Exo呈S100A9依赖性增强CT-26细胞成球能力
3.3.4 GM-Exo呈S100A9依赖性促进结直肠癌细胞表达CD44/CD
3.3.5 GM-Exo呈S100A9依赖性促进CT-26细胞Sox2、Oct4、Nanog及ALDH1A表达
3.3.6 GM-Exo呈S100A9依赖性增加CT-26细胞中ROS水平
3.3.7 GM-Exo呈S100A9依赖性方式促进CT-26细胞Nox4/p-P65/p-Stat3水平
3.3.8 GM-Exo呈S100A9依赖性促进CT-26细胞增殖
3.3.9 GM-Exo呈S100A9依赖性促进肿瘤发展
3.3.10 GM-Exo呈S100A9依赖性促进肿瘤迁移
3.3.11 GM-Exo呈S100A9依赖性促进CT-26细胞肝转移
3.4 讨论
第四章 G-MDSCexosomalS100A9对CAC的作用
4.1 实验仪器和材料
4.1.1 实验仪器
4.1.2 耗材
4.1.3 试剂
4.1.4 实验动物
4.1.5 主要溶液配制
4.2 实验方法
4.2.1 小鼠CAC模型构建
4.2.2 免疫荧光检测GM-Exo在结肠分布
4.2.3 流式细胞术检测GM-Exo在结肠分布
4.2.4 炎症性结直肠癌处理方法
4.2.5 观察指标和标本收集、处理
4.2.6 流式细胞术检测各组织中MDSC-和T细胞亚群
4.2.7 免疫组织化学技术检测结肠局部S100A
4.2.8 H(5)E染色观察结直肠癌组织病理学变化
4.2.9 免疫荧光检测GM-Exo在结肠组织分布
4.2.10 流式细胞计数分析CD133阳性细胞的比例
4.2.11 G-MDSC趋化实验
4.2.12 小鼠CT-26移植瘤模型构建及干预
4.3 结果
4.3.1 构建CAC小鼠模型
4.3.2 外源性GM-Exo易分布至肿瘤局部并且具有累加效果
4.3.3 外源性GM-Exo与肿瘤局部细胞融合
4.3.4 GM-Exo呈S100A9依赖性减轻小鼠体重
4.3.5 GM-Exo呈S100A9依赖性减少CAC小鼠结肠长度
4.3.6 GM-Exo呈S100A9依赖性促进结直肠结节形成
4.3.7 GM-Exo呈S100A9依赖性方式促进结直肠癌进程
4.3.8 GM-Exo呈S100A9依赖性促进结直肠腺瘤形成
4.3.9 结肠组织CD133表达量与GM-Exo分布量呈正相关
4.3.10 GM-Exo呈S100A9依赖性方式增加结直肠组织CD133阳性细胞百分比
4.3.11 肿瘤局部S100A9含量增加
4.3.12 肿瘤局部G-MDSC浸润增多
4.3.13 GM-Exo通过S100A9增加肿瘤局部G-MDSC浸润
4.3.14 GM-Exo依赖于S100A9趋化G-MDSC至外周血和结直肠组织
4.3.15 G-MDS通过S100A9趋化G-MDSC
4.3.16 G-MDSCexosomalS100A9抑制CAC小鼠外周血T细胞数量
4.4 讨论
第五章 缺氧促进G-MDSC分泌exosomes
5.1 实验仪器和材料
5.1.1 实验仪器
5.1.2 耗材
5.1.3 试剂
5.1.4 实验动物
5.1.5 主要溶液配制
5.2 实验方法
5.2.1 脾脏及肿瘤组织来源G-MDSC分泌exosomes能力检测
5.2.2 qRT-PCR检测脾脏及肿瘤来源G-MDSC中HIF-1?和HIF-2?表达量
5.2.3 Westernblot检测G-MDSC中HIF-1?和Rab27a蛋白水平
5.2.4 qRT-PCR检测缺氧和YC-1处理的G-MDSC中HIF-1?表达量
5.2.5 ExoELISA定量G-MDSC分泌的exosoems
5.2.6 Westernblot检测HIF-1?抑制后Rab27a蛋白表达水平
5.3 结果
5.3.1 肿瘤组织来源G-MDSC较脾脏来源G-MDSC分泌exosomes能力增强
5.3.2 肿瘤组织来源G-MDSC较脾脏来源G-MDSC高表达HIF-1?mRNA
5.3.3 缺氧增加脾脏G-MDSC表达HIF-1?和Rab27a蛋白
5.3.4 YC-1抑制G-MDSC中HIF-1?mRNA表达
5.3.5 缺氧呈HIF-1?依赖性促进G-MDSC分泌exosoems
5.3.6 缺氧呈HIF-1?依赖性增强Rab27a蛋白表达
5.4 讨论
第六章 血浆G-MDSCexosomalS100A9在CRC复发中的临床应用
6.1 实验仪器和材料
6.1.1 实验仪器
6.1.2 耗材
6.1.3 试剂
6.1.4 实验动物
6.1.5 主要溶液配制
6.2 实验方法
6.2.1 小鼠血浆exosomes制备
6.2.2 Exosomes定量
6.2.3 Westernblot检测小鼠血浆exosomalS100A9水平
6.2.4 人血浆exosomes制备
6.2.5 流式细胞术分选人血浆CD11b+exosomes
6.2.6 ELISA检测CD11b+exosomes中S100A9含量
6.2.7 ELISA检测人血浆exosomalS100A9含量
6.2.8 CRC患者MDSCexosomalS100A9对SW480干性的作用
6.3 结果
6.3.1 小鼠血浆exosomalS100A9水平检测
6.3.2 FCM检测人血浆CD11b+exosomes负载的胶体颗粒占总颗粒的百比例
6.3.3 ELISA检测血浆CD11b+exosomes和CD11b-exosomes中S100A9含量
6.3.4 ELISA检测人血浆exosomes中S100A9水平
6.3.5 CRC患者肠癌组织M-Exo制备
6.3.6 M-Exo呈S100A9依赖性增强SW480细胞成球能力
6.3.7 CRC患者肿瘤MDSCexosomalS100A9促进SW480移植瘤发生发展
6.4 讨论
结论
参考文献
在学期间发表的学术论文及其他科研成果
致谢
本文编号：3675055
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