PAK1小分子抑制剂AK963/40708899抑制人胃癌细胞增殖迁移及机制研究

发布时间：2022-10-07 21:53

　　目的:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤,在我国其发病率和死亡率居各类肿瘤的首位,因此,寻找胃癌的治疗靶点是当前肿瘤研究领域的热点。许多研究成果显示,激酶信号通路参与肿瘤的发生发展过程,目前已将激酶信号通路确定为肿瘤治疗的靶点,作为未来抗肿瘤药物研发治疗肿瘤的一项新策略。P21活化蛋白激酶1（p21-activated kinase 1,PAK1）作为I类PAK家族的代表,是进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在肿瘤细胞信号转导过程中具有枢纽作用。PAK1是小G蛋白Rho家族的下游靶蛋白,可被生长因子及其他胞外信号活化,并通过与众多的下游结合蛋白或激酶底物相互作用,调控细胞的生物学功能。PAK1除了能够参与细胞骨架的动态调节,还参与其他生物学功能的调节,如生长因子信号通路、类固醇受体通路、有丝分裂等,特别是在细胞的转化,以及肿瘤细胞的侵袭转移过程中有重要作用,因此已成为有效的肿瘤治疗靶点。但目前针对该靶点抑制剂的研究正处于起步阶段。本研究旨在基于已知的PAK1空间结构,采用计算机辅助药物设计方法,进行活性小分子探针设计、合成后,通过高通量筛选,获得效能较高的PAK1小分子抑制剂。并进一步验证该... 

【文章页数】：81 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分：PAK1小分子抑制剂的筛选及活性验证
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 药物配制
            2.2.2 脂质体转染法转染
            2.2.3 免疫共沉淀
            2.2.4 Kinase-Glo~?Luminescent Kinase Assay
            2.2.5 提取蛋白
            2.2.6 WesternBlot
            2.2.7 激酶实验分析检测药物对激酶活性的影响
    3 结果
        3.1 体外Kinase Glo激酶发光法筛选出PAK1小分子抑制剂
        3.2 体外激酶实验检测AK963/40708899对PAK1及Ⅱ类PAK家族成员PAK4和PAK6激酶活性的影响
        3.3 小分子化合物AK963/40708899可以在细胞内抑制PAK1的激酶活性
        3.4 理化性质比较分析结果显示化合物AK963/40708899具有更高的成药性,适合作为先导化合物进行进一步结构修饰和药物研发
    4 讨论
    5 结论
第二部分：小分子化合物AK963抑制人胃癌细胞增殖迁移及机制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 慢病毒转染
            2.2.2 提取蛋白
            2.2.3 脂质体转染法转染
            2.2.4 Western Blot
            2.2.5 免疫共沉淀
            2.2.6 免疫荧光及共聚焦激光扫描显微镜观察
            2.2.7 克隆形成实验
            2.2.8 RNA提取与real-time RT-PCR
            2.2.9 计算机模拟分子对接
    3 结果
        3.1 AK963抑制人胃癌细胞BGC823、SGC7901、MGC803、MKN-l的增殖
        3.2 AK963/40708899下调胃癌细胞细胞周期相关蛋白cyclinBl的表达
        3.3 化合物AK963/40708899抑制PAK1活性,通过NF-κB依赖的方式下调cyclinB1的表达,从而引起G2/M细胞周期阻滞
        3.4 AK963/40708899抑制人胃癌细胞迁移和侵袭
        3.5 AK963抑制胃癌细胞BGC823和SGC7901丝状伪足和促进粘着斑复合体的形成
        3.6 AK963/40708899通过抑制PAK1-LIMKl-cofilin信号通路引起细胞骨架重排,抑制胃癌细胞迁移
        3.7 AK963/40708899通过抑制PAK1,下游以ERK依赖的方式下调FAK的激酶活性,阻碍细胞迁移
        3.8 AK963通过抑制PAK1活性下调MMP9的蛋白和上调Col4A1基因mRNA的表达
        3.9 计算机模拟分子对接显示AK963/40708899与PAK1具有较高亲和力
    4 讨论
    5 结论
第三部分：小分子化合物AK963增强胃癌细胞对化疗药物的敏感性及机制研究
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 慢病毒转染
            2.2.2 提取蛋白
            2.2.3 脂质体转染法转染
            2.2.4 Western Blot
            2.2.5 MTT细胞增殖实验
    3 结果
        3.1 AK963/40708899和紫杉醇联合用药能更有效地抑制人胃癌细胞的增殖
            3.1.1 与单独用药相比,联合用药能更有效抑制人胃癌细胞的增殖
            3.1.2 联合用药能更有效实现胃癌细胞G2/M期阻滞
            3.1.3 联合用药能更有效诱导细胞出现早期凋亡
        3.2 AK963通过PAK1依赖的方式下调微管解聚蛋白stathmin的活性,并通过影响凋亡相关蛋白的表达诱导细胞出现早期凋亡
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历



本文编号：3687485