抑癌蛋白PTEN泛素连接酶WWP2与去泛素化酶USP10的生理调控研究

发布时间：2022-11-05 15:07

　　Pten（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten）基因定位于人第10号染色体,编码由403个氨基酸组成、具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的抑癌蛋白PTEN。自1997克隆并鉴定为抑癌基因以来,其一直作为肿瘤研究领域的明星分子。多种肿瘤病人的组织中都发现了Pten基因的突变与缺失,并且生殖细胞中PTEN的缺失与突变会导致一组常染色体显性遗传综合征（PHTS）,包括Cowden疾病和Bannayan–Riley–Ruvalcaba综合征。PTEN通过发挥磷酸酶活性能特异性将细胞质中的磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸（PIP3）去磷酸化生成磷脂酰肌醇4,5二磷酸（PIP2）,从而抑制PI3K-Akt信号通路发挥抑癌功能。PI3K信号通路的活性与肿瘤的易感性之间存在密切的关联,因此研究PTEN蛋白水平和活性的调控,对于肿瘤的治疗具有重要意义。除此以外,PTEN在细胞核中还可以通过不依赖PI3K信号通路的方式,维持基因组稳定性、调控细胞周期进程以及基因表达,发挥抑癌功能。PTEN是继p53后发现的另一个重要的抑癌蛋白,但相对于p... 

【文章页数】：51 页

【学位级别】：硕士

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缩略词表
摘要
abstract
第一章 前言
    1.1 抑癌蛋白PTEN的重要性
    1.2 PTEN的精细调控与肿瘤的关系
    1.3 PTEN的泛素化与去泛素化调控
    1.4 CRISPR/CAS9基因编辑技术
第二章 实验材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 小鼠DNA提取试剂
        2.1.2 细胞以及组织裂解液
        2.1.3 蛋白免疫印迹试剂
        2.1.4 细胞培养试剂
    2.2 实验方法
        2.2.1 鼠尾DNA的提取与基因型鉴定
        2.2.2 质粒的提取
        2.2.3 细胞或组织RNA的提取
        2.2.4 细胞的培养
        2.2.5 MEF细胞的分离与培养
        2.2.6 蛋白免疫印迹
        2.2.7 蛋白免疫共沉淀
        2.2.8 间接免疫荧光
        2.2.9 克隆形成实验
        2.2.10 Transwell实验
        2.2.11 统计方法
第三章 生理条件下WWP2是PTEN重要的泛素化酶
    3.1 WWP2与CHIP小鼠的基因型鉴定
    3.2 WWP2敲除的小鼠体型变小,体重变轻
    3.3 CHIP敲除后小鼠的生长发育阻滞
    3.4 WWP2敲除后PTEN的蛋白水平上升,AKT通路受到抑制
    3.5 WWP2基因敲除不影响PTEN的转录水平
    3.6 WWP2敲除后PTEN的泛素化水平增加
    3.7 CHIP 缺失既不影响 PTEN 的蛋白水平，也不影响其泛素化水平
    3.8 小结
    3.9 讨论
第四章 USP10通过去泛素化稳定PTEN
    4.1 USP10基因敲除细胞株的构建
        4.1.1 sgRNA序列的设计
        4.1.2 重组质粒的构建与鉴定
        4.1.3 病毒的包装
        4.1.4 USP10基因敲除细胞株的构建与筛选
    4.2 USP10 敲除后细胞的增殖和迁移能力增强
    4.3 USP10 敲除后，PTEN 的蛋白水平下降，AKT 信号通路激活
    4.4 USP10敲除后PTEN的泛素化水平明显增加
    4.5 USP10 敲除后细胞质和细胞核 PTEN 蛋白水平都下降
    4.6 小结
    4.7 讨论
第五章 结论与展望
参考文献
附录A 基因型鉴定引物
附录B 实验仪器
作者在学期间取得的学术成果
个人简历
致谢



本文编号：3702829