PPARγ介导c-Myc自噬降解并抑制肿瘤生长
发布时间：2022-12-18 18:56
自噬是真核细胞的一个保守过程,可以将细胞质中的蛋白质、矿物质、脂质体或者损伤线粒体、核糖体、细胞核转移至溶酶体中进行降解。c-Myc作为一种原癌基因在促进多种恶性肿瘤生长方面发挥重要作用。c-Myc可以通过靶向多种与代谢相关的基因进而调控肿瘤细胞的代谢。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是一类由配体结合并激活的核激素受体,同时也具有抑制肿瘤生长的作用。在这里,本实验发现PPARγ包含一个LIR结构域（LC3相互作用区域）,该结构域可以介导c-Myc选择性自噬降解且不依赖于PPARγ的转录活性。在这个过程中,PPARγ与LC3B相互作用并且将c-Myc转移至自噬溶酶体中从而导致其在溶酶体中降解。此外,PPARγ介导的c-Myc自噬降解可以抑制肿瘤生长。本课题的结果如下:1、Western blot分析表明PPARγ过表达后能降低c-Myc蛋白水平且不影响基因的转录。此外PPARγ降低c-Myc蛋白水平独立于PPARγ转录活性。相反,在PPARγshRNA沉默SW480细胞中发现这个过程被逆转。2、Western blot分析证实PPARγ能通过溶酶体途径降解c-Myc而不是蛋白酶...
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 过氧化物酶体增殖物激活受体γ
1.1.1 PPARγ
1.1.2 PPARγ和肿瘤
1.2 c-Myc
1.2.1 c-Myc概论
1.2.2 c-Myc与肿瘤细胞代谢
1.3 肿瘤与自噬
1.3.1 自噬
1.3.2 自噬和肿瘤代谢
1.4 本研究的意义
1.5 主要研究内容和技术路线
1.5.1 主要研究内容
1.5.2 技术路线
第二章 PPARγ诱导c-Myc自噬降解
2.1 实验材料
2.1.1 实验所需细胞以及质粒
2.1.2 实验仪器及实验耗材
2.1.3 所需实验试剂以及配制方法
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 质粒扩增及提取
2.2.3 细胞转染
2.2.4 细胞总蛋白提取
2.2.5 细胞总蛋白的浓度测定
2.2.6 蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白含量变化
2.2.7 双荧光素酶报告基因法检测PPARγ核定位序列以及DNA结合结构域缺失后对其自身转录活性的影响
2.2.8 实时荧光定量PCR检测PPARγ对c-Myc基因水平的影响
2.3 实验结果
2.3.1 PPARγ减少c-Myc蛋白水平独立于PPARγ转录活力
2.3.2 PPARγ介导的c-Myc自噬降解
2.4 本章小结
第三章 PPARγ与c-Myc相互作用
3.1 实验材料
3.1.1 实验所需细胞以及质粒
3.1.2 实验仪器及其试剂
3.2 实验方法
3.2.1 细胞培养
3.2.2 质粒扩增及提取
3.2.3 细胞转染
3.2.4 免疫共沉淀实验
3.2.5 免疫荧光实验
3.2.6 细胞总蛋白提取
3.2.7 细胞总蛋白的浓度测定
3.2.8 蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白含量变化
3.3 实验结果
3.3.1 PPARγ与内源性c-Myc存在相互作用
3.4 本章小结
第四章 PPARγ的LIR结构域是诱导c-Myc降解的关键
4.1 实验材料
4.1.1 实验所需细胞以及质粒
4.1.2 实验仪器及试剂
4.2 实验方法
4.2.1 细胞培养
4.2.2 质粒扩增及提取
4.2.3 细胞转染
4.2.4 BL21菌种感受态的制备
4.2.5 GST纯化蛋白
4.2.6 GST pull-down
4.2.7 免疫荧光实验
4.2.8 细胞总蛋白提取
4.2.9 细胞总蛋白浓度测定
4.2.10 蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白含量变化
4.3 实验结果
4.3.1 PPARγ与LC3B存在相互作用
4.3.2 PPARγ/F70是PPARγ诱导c-Myc自噬降解的关键位点
4.4 本章小结
第五章 PPARγ/c-Myc通路抑制肿瘤生长
5.1 实验材料
5.1.1 实验所需细胞以及质粒
5.1.2 实验仪器及其试剂
5.2 实验方法
5.2.1 筛选稳定表达的细胞系
5.2.2 细胞计数
5.2.3 软琼脂克隆集落形成实验
5.2.4 准备裸鼠
5.2.5 扩大培养
5.2.6 构建异植瘤裸鼠模型
5.2.7 取肿瘤
5.2.8 肿瘤组织总蛋白提取
5.2.9 肿瘤细胞总蛋白浓度测定
5.2.10 蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白含量变化
5.2.11 葡萄糖消耗的检测
5.2.12 乳酸盐释放的检测
5.3 统计学分析
5.4 实验结果
5.4.1 PPARγ/F70位点是抑制肿瘤生长的关键位点
5.4.2 PPARγ诱导c-Myc自噬降解影响肿瘤细胞的葡萄糖摄取
5.5 本章小结
第六章 总结
6.1 PPARγ诱导c-Myc自噬降解
6.2 PPARγ与c-Myc相互作用
6.3 PPARγ中的LC3相互作用域是诱导c-Myc降解的关键
6.4 PPARγ/c-Myc通路抑制肿瘤生长
参考文献
致谢
在读期间的学术成果
本文编号：3722585
【文章页数】：77 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 绪论
1.1 过氧化物酶体增殖物激活受体γ
1.1.1 PPARγ
1.1.2 PPARγ和肿瘤
1.2 c-Myc
1.2.1 c-Myc概论
1.2.2 c-Myc与肿瘤细胞代谢
1.3 肿瘤与自噬
1.3.1 自噬
1.3.2 自噬和肿瘤代谢
1.4 本研究的意义
1.5 主要研究内容和技术路线
1.5.1 主要研究内容
1.5.2 技术路线
第二章 PPARγ诱导c-Myc自噬降解
2.1 实验材料
2.1.1 实验所需细胞以及质粒
2.1.2 实验仪器及实验耗材
2.1.3 所需实验试剂以及配制方法
2.2 实验方法
2.2.1 细胞培养
2.2.2 质粒扩增及提取
2.2.3 细胞转染
2.2.4 细胞总蛋白提取
2.2.5 细胞总蛋白的浓度测定
2.2.6 蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白含量变化
2.2.7 双荧光素酶报告基因法检测PPARγ核定位序列以及DNA结合结构域缺失后对其自身转录活性的影响
2.2.8 实时荧光定量PCR检测PPARγ对c-Myc基因水平的影响
2.3 实验结果
2.3.1 PPARγ减少c-Myc蛋白水平独立于PPARγ转录活力
2.3.2 PPARγ介导的c-Myc自噬降解
2.4 本章小结
第三章 PPARγ与c-Myc相互作用
3.1 实验材料
3.1.1 实验所需细胞以及质粒
3.1.2 实验仪器及其试剂
3.2 实验方法
3.2.1 细胞培养
3.2.2 质粒扩增及提取
3.2.3 细胞转染
3.2.4 免疫共沉淀实验
3.2.5 免疫荧光实验
3.2.6 细胞总蛋白提取
3.2.7 细胞总蛋白的浓度测定
3.2.8 蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白含量变化
3.3 实验结果
3.3.1 PPARγ与内源性c-Myc存在相互作用
3.4 本章小结
第四章 PPARγ的LIR结构域是诱导c-Myc降解的关键
4.1 实验材料
4.1.1 实验所需细胞以及质粒
4.1.2 实验仪器及试剂
4.2 实验方法
4.2.1 细胞培养
4.2.2 质粒扩增及提取
4.2.3 细胞转染
4.2.4 BL21菌种感受态的制备
4.2.5 GST纯化蛋白
4.2.6 GST pull-down
4.2.7 免疫荧光实验
4.2.8 细胞总蛋白提取
4.2.9 细胞总蛋白浓度测定
4.2.10 蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白含量变化
4.3 实验结果
4.3.1 PPARγ与LC3B存在相互作用
4.3.2 PPARγ/F70是PPARγ诱导c-Myc自噬降解的关键位点
4.4 本章小结
第五章 PPARγ/c-Myc通路抑制肿瘤生长
5.1 实验材料
5.1.1 实验所需细胞以及质粒
5.1.2 实验仪器及其试剂
5.2 实验方法
5.2.1 筛选稳定表达的细胞系
5.2.2 细胞计数
5.2.3 软琼脂克隆集落形成实验
5.2.4 准备裸鼠
5.2.5 扩大培养
5.2.6 构建异植瘤裸鼠模型
5.2.7 取肿瘤
5.2.8 肿瘤组织总蛋白提取
5.2.9 肿瘤细胞总蛋白浓度测定
5.2.10 蛋白质免疫印迹法检测目的蛋白含量变化
5.2.11 葡萄糖消耗的检测
5.2.12 乳酸盐释放的检测
5.3 统计学分析
5.4 实验结果
5.4.1 PPARγ/F70位点是抑制肿瘤生长的关键位点
5.4.2 PPARγ诱导c-Myc自噬降解影响肿瘤细胞的葡萄糖摄取
5.5 本章小结
第六章 总结
6.1 PPARγ诱导c-Myc自噬降解
6.2 PPARγ与c-Myc相互作用
6.3 PPARγ中的LC3相互作用域是诱导c-Myc降解的关键
6.4 PPARγ/c-Myc通路抑制肿瘤生长
参考文献
致谢
在读期间的学术成果
本文编号：3722585
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/3722585.html
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