以Hsp90/Cdc37复合物为靶点的Hsp90抑制剂的研究
发布时间：2023-02-10 07:41
热休克蛋白90(90 k Da heat shock protein,Hsp90)是普遍存在于原核和真核细胞中的一种必不可少且高度保守的分子伴侣,通过与细胞内多种客户蛋白形成复合体,协助这些客户蛋白在细胞内转运、跨膜,参与蛋白质的折叠、伸展及多聚复合体的组装,从而起到维持细胞内蛋白质稳定的作用。研究证实,Hsp90在多种癌症细胞中表达水平均明显上升,Hsp90可以通过帮助其下游多种致癌客户蛋白的折叠、装配和成熟,促进癌细胞的生存和侵袭,并对癌症细胞在面对体内外许多不利环境(如放、化疗)时具有保护作用。因此,抑制Hsp90活性已经成为癌症治疗的一个有效策略。在过去的二十年里,涌现出了多种Hsp90抑制剂,如嘌呤支架类化合物格尔德霉素(geldanamycin)及其衍生物17-AAG、天然产物根赤壳菌素(radicicol)和一些小分子肽类等。这些Hsp90抑制剂多以阻断Hsp90 N端的ATP结合位点为机制。迄今为止,已有17种药物进入临床试验。然而,细胞内广泛存在的其他ATP酶使得这些药物无法做到高度特异,其临床效果均不理想,至今未有一个通过美国食品与药品管理局(Food and Dr...
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
第1章 绪论
1.1 热休克蛋白 90
1.1.1 热休克蛋白
1.1.2 热休克蛋白90及其结构
1.1.3 热休克蛋白90的共分子伴侣及客户蛋白
1.1.4 热休克蛋白90与肿瘤的关系
1.2 热休克蛋白90抑制剂
1.2.1 Hsp90的N-端抑制剂
1.2.2 Hsp90的C-端抑制剂
1.2.3 Hsp90的中间结构域抑制剂以及结合位点尚未明确的抑制剂
1.3 热休克蛋白90与共分子伴侣细胞分裂周期蛋白 37
1.3.1 细胞分裂周期蛋白 37
1.3.2 Hsp90/Cdc37抑制剂
1.4 海肾荧光素酶双分子互补技术
1.5 研究目的和理论意义
第2章 基于Hsp90/Cdc37结构的新型Hsp90抑制剂筛选体系的建立
2.1 背景
2.2 实验材料与仪器
2.2.1 质粒和菌株
2.2.2 试剂和耗材
2.2.3 溶液配制
2.2.4 引物
2.2.5 仪器
2.3 实验方法
2.3.1 重组质粒的构建
2.3.2 IPTG诱导蛋白的表达及纯化
2.3.3 SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析
2.3.4 点突变
2.3.5 互补RL活性优化及化合物处理
2.4 实验结果
2.4.1 质粒构建
2.4.2 NRL-Hsp90α 和Cdc37-CRL融合蛋白的表达和纯化
2.4.3 互补RL活性的优化
2.4.4 体外SRL-PFAC分析系统的特异性检测
2.4.5 化合物处理
2.5 讨论与小结
2.5.1 讨论
2.5.2 小结
第3章 芹菜素通过阻断Hsp90/Cdc37抑制胰腺癌细胞生长和迁移作用研究
3.1 背景
3.2 实验材料与仪器
3.2.1 材料
3.2.2 试剂
3.2.3 溶液配制
3.2.4 引物
3.2.5 仪器
3.3 实验方法
3.3.1 细胞培养
3.3.2 细胞转染及RL分析
3.3.3 点突变
3.3.4 免疫印迹和免疫共沉淀
3.3.5 MTS实验分析
3.3.6 划痕实验分析
3.3.7 胞内ROS检测分析
3.4 实验结果
3.4.1 SRL-PFAC分析结果表明芹菜素在HEK293细胞中能够阻断Hsp90/Cdc37相互作用
3.4.2 芹菜素阻断Hsp90/Cdc37相互作用的功能并不依赖于CK2激酶活性
3.4.3 芹菜素在胰腺癌细胞中能够阻断Hsp90/Cdc37复合物形成并诱导下游客户蛋白降解
3.4.4 芹菜素能够抑制胰腺癌细胞的生长
3.4.5 芹菜素能够抑制胰腺癌细胞的迁移
3.4.6 芹菜素能够在胰腺癌细胞中诱导ROS的积累
3.5 讨论与小结
3.5.1 讨论
3.5.2 小结
第4章 结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
本文编号：3739288
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略词表
第1章 绪论
1.1 热休克蛋白 90
1.1.1 热休克蛋白
1.1.2 热休克蛋白90及其结构
1.1.3 热休克蛋白90的共分子伴侣及客户蛋白
1.1.4 热休克蛋白90与肿瘤的关系
1.2 热休克蛋白90抑制剂
1.2.1 Hsp90的N-端抑制剂
1.2.2 Hsp90的C-端抑制剂
1.2.3 Hsp90的中间结构域抑制剂以及结合位点尚未明确的抑制剂
1.3 热休克蛋白90与共分子伴侣细胞分裂周期蛋白 37
1.3.1 细胞分裂周期蛋白 37
1.3.2 Hsp90/Cdc37抑制剂
1.4 海肾荧光素酶双分子互补技术
1.5 研究目的和理论意义
第2章 基于Hsp90/Cdc37结构的新型Hsp90抑制剂筛选体系的建立
2.1 背景
2.2 实验材料与仪器
2.2.1 质粒和菌株
2.2.2 试剂和耗材
2.2.3 溶液配制
2.2.4 引物
2.2.5 仪器
2.3 实验方法
2.3.1 重组质粒的构建
2.3.2 IPTG诱导蛋白的表达及纯化
2.3.3 SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析
2.3.4 点突变
2.3.5 互补RL活性优化及化合物处理
2.4 实验结果
2.4.1 质粒构建
2.4.2 NRL-Hsp90α 和Cdc37-CRL融合蛋白的表达和纯化
2.4.3 互补RL活性的优化
2.4.4 体外SRL-PFAC分析系统的特异性检测
2.4.5 化合物处理
2.5 讨论与小结
2.5.1 讨论
2.5.2 小结
第3章 芹菜素通过阻断Hsp90/Cdc37抑制胰腺癌细胞生长和迁移作用研究
3.1 背景
3.2 实验材料与仪器
3.2.1 材料
3.2.2 试剂
3.2.3 溶液配制
3.2.4 引物
3.2.5 仪器
3.3 实验方法
3.3.1 细胞培养
3.3.2 细胞转染及RL分析
3.3.3 点突变
3.3.4 免疫印迹和免疫共沉淀
3.3.5 MTS实验分析
3.3.6 划痕实验分析
3.3.7 胞内ROS检测分析
3.4 实验结果
3.4.1 SRL-PFAC分析结果表明芹菜素在HEK293细胞中能够阻断Hsp90/Cdc37相互作用
3.4.2 芹菜素阻断Hsp90/Cdc37相互作用的功能并不依赖于CK2激酶活性
3.4.3 芹菜素在胰腺癌细胞中能够阻断Hsp90/Cdc37复合物形成并诱导下游客户蛋白降解
3.4.4 芹菜素能够抑制胰腺癌细胞的生长
3.4.5 芹菜素能够抑制胰腺癌细胞的迁移
3.4.6 芹菜素能够在胰腺癌细胞中诱导ROS的积累
3.5 讨论与小结
3.5.1 讨论
3.5.2 小结
第4章 结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文
致谢
本文编号：3739288
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/zlx/3739288.html
