miR-5002-5p响应叶酸缺乏并通过靶向调控Gadd45α影响HCT-116细胞迁移能力的研究

发布时间：2023-02-14 19:45

　　叶酸(folate)隶属于B族维生素,是一碳代谢的关键组分。叶酸与DNA甲基化、DNA合成的保真性及损伤修复息息相关。叶酸缺乏对上述DNA正常代谢活动具有胁迫作用,从而提高多种遗传-环境相关疾病的风险,包括肿瘤的发生发展。Gadd45α是一种DNA损伤修复和细胞生长阻滞蛋白,在特定环境胁迫和DNA损伤后表达量可显著增加,并诱发细胞周期阻滞和凋亡。前期研究提示miRNAs可响应叶酸缺乏并调控靶基因的表达,影响一系列生物学过程。本文围绕(1)叶酸缺乏下人结直肠癌细胞株HCT-116迁移能力和Gadd45α表达的改变;(2)miR-5002-5p对Gadd45α的靶向调控及其介导的细胞迁移能力的变化开展研究。旨在为特定miRNA响应叶酸缺乏后对靶基因表达及相关生物学过程的影响提供进一步的科学证据。依据本实验室对基因组稳定性维护的叶酸浓度界定,以氧化型叶酸(folic acid,FA)缺乏浓度(22.6 nmol/L)和充足浓度(2260 nmol/L)分别干预培养HCT-116细胞;根据FA缺乏对Gadd45α表达影响以及分别转染特异小干扰RNA(siGadd45α)和miR-5002-5p...

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
缩略词简表
第1章 前言
    1.1 叶酸与基因组稳定性、肿瘤发生和抗肿瘤研究
    1.2 miRNAs响应叶酸缺乏及其对靶基因的调控
    1.3 Gadd45α对肿瘤细胞凋亡、自噬及侵袭转移能力的调控
第2章 实验材料及实验方法
    2.1 实验材料和实验用试剂
        2.1.1 实验用细胞株
        2.1.2 主要仪器设备与试剂
        2.1.3 主要化学试剂
    2.2 实验方法与步骤
        2.2.1 细胞培养和干预
            2.2.1.1 细胞常规培养
            2.2.1.2 细胞干预培养
            2.2.1.3 siGadd45α和 miR-5002-5p模拟物分别转染HCT-116 细胞
        2.2.2细胞迁移能力检测实验
            2.2.2.1 Transwell实验
            2.2.2.2划痕实验
        2.2.3 RT-qPCR实验
            2.2.3.1 miRNA和 m RNA的提取
            2.2.3.2 miRNA反转录
            2.2.3.3 miR-5002-5p表达量的测定
            2.2.3.4 mRNA的反转录
            2.2.3.5 Gadd45α和 E-cadherin转录水平表达量的测定
        2.2.4 Western Blot实验
            2.2.4.1 试剂配置(见附录A)
            2.2.4.2 细胞总蛋白提取
            2.2.4.3 Gadd45α翻译水平表达量的测定
        2.2.5载体构建和双荧光素酶报告基因检测实验
            2.2.5.1 Gadd45α3’UTR野生型质粒构建
            2.2.5.2 Gadd45α3’UTR突变型质粒构建
            2.2.5.3 双荧光素酶报告基因检测miR-5002-5p与 Gadd45α的靶向性
            2.2.5.4 双荧光素酶报告基因结果检测与分析
第3章 实验结果
    3.1 FA缺乏抑制HCT-116细胞的迁移能力
    3.2 Gadd45α响应FA缺乏抑制HCT-116 细胞迁移能力
        3.2.1 FA缺乏诱导HCT-116 细胞Gadd45α表达
        3.2.2 沉默Gadd45α表达促进HCT-116 细胞的迁移能力
    3.3 Gadd45α响应FA缺乏的分子机制
        3.3.1 靶向调控Gadd45α的 miRNAs预测
        3.3.2 Gadd45α3’UTR野生型质粒构建
        3.3.3 Gadd45α3’UTR突变型质粒构建
        3.3.4 双荧光素酶验证miR-5002-5p与 Gadd45α的靶向性
        3.3.5 FA缺乏通过抑制miR-5002-5p上调Gadd45α
    3.4 miR-5002-5p响应FA缺乏并抑制HCT-116 细胞迁移能力的可能机制初探
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
附录 A 自配试剂和溶液配方
附录 B 序列信息
攻读学位期间完成的学术论文和研究成果
致谢



本文编号：3742901