靶向CD19和PDL1的新型双亲和力CAR T细胞的功能与机制研究

发布时间：2023-02-19 07:55

　　研究目的:肿瘤的免疫抑制微环境(TIME)是影响嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗效(尤其是实体肿瘤)的主要问题之一[1]。程序性死亡-1(PD-1;CD279)是一种位于细胞表面的I型跨膜受体,同时也是T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞甚至活化的血管内皮细胞上表达最广泛的T细胞抑制受体[2]。PD-1通路在所有免疫抑制信号通路上似乎是一个“主开关”,因为在某些情况下,单一剂量的抗PD治疗可以使得肿瘤微环境从最初的高度抑制状态变为高度活跃的炎症部位[3]。许多癌症类型过度表达PD-L1,通过PD-1/PD-L1/2相互作用损害T细胞的抗肿瘤反应以逃避免疫系统的攻击[4]。但是PD1-PDL1通路对于维持正常的外周免疫耐受也非常重要,如果直接靶向PDL1可能会引起非常严重的脱靶效应。如何通过CAR的结构改造使得CAR T细胞以调节CAR对于不同靶点的亲和力,使得CAR T细胞既可以避免PD1的免疫抑制信号,又不至于产生脱靶是一个非常有价值的研究的课题。研究内容和方法:我们将PD1的部分片段插入到针对CD19的二代CAR的结构中,制备靶向CD19和PDL1的新型的双亲和力...

【文章页数】：125 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
前言
第一章 CART细胞的制备
    1.1 实验材料
        1.1.1 健康供者的PBMC
        1.1.2 慢病毒
        1.1.3 实验试剂
        1.1.4 实验仪器
    1.2 实验方法
        1.2.1 CAR的结构示意图
        1.2.2 CAR结构的序列
        1.2.3 慢病毒载体示意图
        1.2.4 分选PBMC细胞
        1.2.5 分选CD3⁺T细胞
        1.2.6 转染CAR的慢病毒
        1.2.7 CAR T细胞的表达效率的检测
    1.3 实验结果
    1.4 结果讨论
第二章 CART的体外功能实验
    2.1 实验材料
        2.1.1 细胞系
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 实验耗材
    2.2 实验方法
        2.2.1 检测肿瘤细胞系CD19和PDL1的表达
        2.2.2 制备表达CD19和PDL1的细胞系
        2.2.3 CART细胞对表达CD19+/-和或PDL1+/-靶细胞杀伤效率的检测
        2.2.4 CAR T细胞对786o和786o-CD19 细胞的杀伤(显微镜观察结果)
        2.2.5 CART细胞和肿瘤细胞孵育24h之后,培养液上清细胞因子的检测(ELAS检测法)
        2.2.6 CAR T细胞和肿瘤细胞孵育之后的细胞因子的检测(LEGNplex TM human panel多因子试剂盒检测法)
        2.2.7 CAR T细胞和对CD19 蛋白亲和力的检测
        2.2.8 CART细胞的特异性增殖
        2.2.9 CAR T细胞的表型检测
        2.2.10 CAR T 细胞和 NALM-6 细胞孵育之后的抑制 marker 表达
        2.2.11 CAR T 细胞和 NALM-6-PDL1 孵育之后的 CAR T 细胞的转录组分析
        2.2.12 CAR T 细胞的线粒体压力检测
        2.2.13 CAR T 细胞的糖酵解速率检测
        2.2.14 统计学方法
    2.3 实验结果
        2.3.1 肿瘤细胞系 CD19 和/或 PDL1 的表达情况
        2.3.2 CAR T细胞对于CD19-PDL1-和CD19+PDL1-细胞的杀伤效率
        2.3.3 CAR T细胞对于CD19+PDL1+细胞的杀伤效率
        2.3.4 CAR T细胞对于CD19-PDL1+细胞的杀伤效率
        2.3.5 CART细胞对于K562, K562-PDL1, NALM-6-PDL1 和NALM-6-PDL1 细胞的杀伤效率
        2.3.6 PD1-BAT1,2细胞的特异性增殖
        2.3.7 PD1-BAT3细胞的特异性增殖
        2.3.8 倒置显微镜下CART细胞对肿瘤细胞的杀伤效果
        2.3.9 荧光显微镜下CART细胞对肿瘤细胞的杀伤效果
        2.3.10 CAR T细胞IFN-γ,TNF-α和 IL-2 的分泌量的检测
        2.3.11 CAR T细胞IFN-γ,IL-21,TNF-α,IL-10,IL-2和IL-6 的分泌量的检测
        2.3.12 CAR T细胞对于CD19 蛋白的亲和力
        2.3.13 CART细胞在培养过程中的增殖情况
        2.3.14 CART的分化表型检测
        2.3.15 PD1-BAT2/3CART细胞分别和NALM-6 细胞孵育24 小时后其免疫抑制marker的差异检测
        2.3.16 2G-T 和 PD1-BAT2 代谢和分化的转录组的差异
        2.3.17 2G-T 和 PD1-BAT3 代谢和分化的转录组的差异
        2.3.18 残余肿瘤细胞的检测
        2.3.19 PD1-BAT3 的有氧代谢速率比2G-T细胞更高
        2.3.20 PD1-BAT3 细胞和2G-T细胞的ECAR速率类似
    2.4 结果讨论
        2.4.1 不同结构的CART细胞具有不同的靶向性
        2.4.2 铰链区和跨膜区的长度影响CART细胞的功能
        2.4.3 CART细胞对靶蛋白的亲和力影响其功能
        2.4.4 PD1-BAT2/3 和肿瘤细胞孵育后其抑制分子的marker表达量比经典二代CART细胞的表达量更低
        2.4.5 PD1-BAT2/3CART细胞的代谢模式和分化表型预示着更好的抗肿瘤活性
        2.4.6 T细胞的代谢类型和其分化表型有密切的关系
        2.4.7 改变代谢的类型来增强T细胞的功能
        2.4.8 优化CAR的结构促进其抗肿瘤的能力
        2.4.9 通过转染特定类型的T细胞以提高CART细胞的安全性和有效性
        2.4.10 改变CAR T细胞的微环境来增强CAR T细胞的功能
        2.4.11 CART治疗肿瘤过程中不良反应的讨论
第三章 CART细胞的动物实验
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验所用小鼠和细胞
        3.1.2 实验试剂,耗材和仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 PD1-BAT2 细胞回输给NSG负瘤NALM-6-PDL1 的小鼠模型
        3.2.2 PD1-BAT3 细胞回输给NSG负瘤NALM-6-PDL1 的小鼠模型
        3.2.3 统计学方法
    3.3 实验结果
        3.3.1 回输不同的CART细胞之后对NSG小鼠的肿瘤负荷的活体成像
        3.3.2 回输不同的CAR T细胞之后对NSG小鼠的肿瘤负荷的荧光强度变化
        3.3.3 小鼠的生存曲线的统计
        3.3.4 PD1-BAT1组NSG小鼠会出现辐射样不良反应
        3.3.5 回输不同CAR T细胞之后NSG小鼠的肿瘤负荷的活体成像
        3.3.6 小鼠的肿瘤负荷的变化
        3.3.7 小鼠的生存曲线
        3.3.8 小鼠体内的细胞因子(IFN-γ和 IL2)变化情况
    3.4 结果讨论
第四章 探索CAR的结构和CAR T细胞功能的关系
    4.1 实验材料
        4.1.1 实验试剂和耗材
        4.1.2 实验仪器
    4.2 实验方法:CART的构建及功能验证
    4.3 实验结果
        4.3.1 CART细胞的体外杀伤结果
        4.3.2 CART细胞的细胞因子分泌量
        4.3.3 在NALM-6 的高肿瘤负荷的NSG小鼠中,不同结构的CART细胞对于肿瘤负荷的控制
        4.3.4 流式检测小鼠不同脏器的肿瘤负荷
        4.3.5 在NALM-6 的低肿瘤负荷的NSG小鼠中,不同结构的CART细胞对于肿瘤负荷的控制
    4.4 结果讨论
第五章 结论和展望
参考文献
附录 A 不同CAR的核苷酸序列
附录 B 综述 改进CAR-T细胞有效性和安全性的设计策略
作者在学期间取得的学术成果
主要简历
致谢



本文编号：3745832