MicroRNA-16-5p在前列腺癌细胞辐射应答中的作用及其机制研究

发布时间：2023-04-01 07:00

　　前列腺癌是全球男性第二大常见癌症。在中国,国家癌症中心发布的最新全国癌症统计报告明确指出,男性前列腺癌近年来的上升趋势明显,已位居男性发病第六位,在未来的肿瘤防控中应该重点关注。放疗具有疗效好、适应症广且并发症少等特点,是一种最常见的、疗效明确的前列腺癌治疗方法。然而,大约有三分之一的前列腺癌患者最终会出现放疗后复发。因此,如何提高前列腺癌的放射治疗效果,有效杀伤肿瘤细胞,仍然是目前临床医生和科研人员亟待解决的问题。重离子是国际上公认的21世纪最理想的放疗用射线,特别适宜于外科手术、化疗、常规放疗无效或易复发的难治病例。我们的研究也发现在前列腺癌细胞中,碳离子辐照与传统的X射线辐照相比,表现出明显的优势,包括造成更严重的DNA损伤,对细胞的活力具有更强的抑制作用,导致更高水平的细胞周期阻滞以及细胞凋亡等,为碳离子在前列腺癌临床治疗中的应用提供了一些基础数据。MicroRNAs(MiRNAs)可以通过调控多种靶基因的表达,进而在细胞电离辐射应答的各个阶段发挥作用。因此,我们通过mi RNA探针杂交芯片技术对碳离子和X射线辐射后前列腺癌细胞中的miRNA表达谱进行分析。结果发现,碳离子及X...

【文章页数】：128 页

【学位级别】：博士

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摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 前列腺癌现状与放射治疗
        1.1.1 前列腺癌现状
        1.1.2 前列腺癌放射治疗进展
    1.2 MicroRNA与前列腺癌辐射应答
        1.2.1 MicroRNA在前列腺癌中的作用
        1.2.2 MicroRNA在前列腺癌辐射应答中的作用
    1.3 MicroRNA与前列腺癌辐射敏感性
        1.3.1 MicroRNA通过DDR调节前列腺癌辐射敏感性
        1.3.2 MicroRNA通过细胞周期检查点调节前列腺癌辐射敏感性
        1.3.3 MicroRNA通过凋亡和自噬调节前列腺癌辐射敏感性
        1.3.4 MicroRNA通过缺氧反应调节前列腺癌辐射敏感性
        1.3.5 MicroRNA通过EMT调节前列腺癌辐射敏感性
        1.3.6 MicroRNA通过肿瘤干细胞调节前列腺癌辐射敏感性
    1.4 MicroRNA作为前列腺癌放射治疗的标志物与靶点
        1.4.1 MicroRNA作为前列腺癌放射治疗的标志物
        1.4.2 MicroRNA作为前列腺癌放射治疗的靶点
    1.5 本文的研究目的及意义
第二章 重离子及X射线辐照对前列腺癌细胞辐射应答的影响
    2.1 引言
    2.2 材料与试剂
        2.2.1 实验细胞
        2.2.2 主要试剂
        2.2.3 主要仪器
    2.3 实验方法和步骤
        2.3.1 细胞培养
            2.3.1.1 细胞复苏
            2.3.1.2 细胞传代
            2.3.1.3 细胞冻存
        2.3.2 辐照处理
            2.3.2.1 重离子辐照
            2.3.2.2 X射线辐照
        2.3.3 细胞增殖实验
        2.3.4 克隆形成实验
        2.3.5 免疫荧光实验
        2.3.6 细胞周期检测
        2.3.7 Hoechst33258 染色实验
        2.3.8 细胞凋亡检测
        2.3.9 Western Blot蛋白免疫印迹实验
        2.3.10 数据统计分析
    2.4 实验结果
        2.4.1 不同前列腺癌细胞的辐射敏感性具有差异
        2.4.2 碳离子辐照诱导更严重的DNA双链断裂(DSB)损伤
        2.4.3 碳离子辐照引起DNA的团簇性损伤
        2.4.4 碳离子及X射线辐照对前列腺癌细胞生存活力的影响
        2.4.5 碳离子及X射线辐照对前列腺癌细胞周期分布的影响
        2.4.6 碳离子及X射线辐照对前列腺癌细胞凋亡的影响
        2.4.7 碳离子及X射线辐照对前列腺癌细胞micro RNA表达的影响
    2.5 讨论
第三章 MicroRNA-16-5p通过靶向AKT3 在前列腺癌细胞中发挥抑癌作用
    3.1 引言
    3.2 材料与试剂
        3.2.1 实验细胞
        3.2.2 主要试剂
        3.2.3 主要仪器
    3.3 实验方法和步骤
        3.3.1 细胞培养
        3.3.2 细胞增殖实验
        3.3.3 克隆形成实验
        3.3.4 细胞周期检测
        3.3.5 细胞凋亡检测
        3.3.6 细胞总RNA提取
        3.3.7 MicroRNA反转录PCR(Reverse Transcript PCR,RT-PCR)
        3.3.8 MicroRNA实时定量q RT-PCR(Quantitative Real Time PCR)
        3.3.9 mRNA反转录PCR(Reverse Transcript PCR,RT-PCR)
        3.3.10 mRNA实时定量q RT-PCR(Quantitative Real Time PCR)
        3.3.11 细胞瞬时转染
        3.3.12 双荧光素酶报告基因实验
        3.3.13 Western Blot蛋白免疫印迹实验
        3.3.14 细胞划痕实验
        3.3.15 数据统计分析
    3.4 实验结果
        3.4.1 Mir-16-5p在前列腺癌中低表达
        3.4.2 过表达miR-16-5p抑制前列腺癌细胞的增殖
        3.4.3 过表达miR-16-5p抑制前列腺癌细胞的克隆形成能力
        3.4.4 过表达miR-16-5p诱导前列腺癌细胞的凋亡
        3.4.5 过表达miR-16-5p调控前列腺癌细胞的周期分布
        3.4.6 过表达miR-16-5p对细胞迁移的影响
        3.4.7 AKT3是mi R-16-5p的靶基因
        3.4.8 Mi R-16-5p靶向抑制AKT3 的表达并参与调控PI3K/AKT/m TOR信号通路
        3.4.9 运用si RNAs敲低AKT3 的表达
        3.4.10 敲低AKT3抑制前列腺癌细胞的增殖能力
        3.4.11 敲低AKT3抑制前列腺癌细胞的克隆形成能力
        3.4.12 敲低AKT3影响前列腺癌细胞的周期分布
        3.4.13 敲低AKT3对前列腺癌细胞凋亡的影响
    3.5 讨论
第四章 MicroRNA-16-5p通过调节Cyclin D1/E1-p Rb-E2F1信号通路增强前列腺癌细胞的辐射敏感性
    4.1 引言
    4.2 材料与试剂
        4.2.1 实验细胞
        4.2.2 主要试剂
        4.2.3 主要仪器
    4.3 实验方法和步骤
        4.3.1 细胞培养
        4.3.2 辐照处理
        4.3.3 细胞增殖实验
        4.3.4 克隆形成实验
        4.3.5 细胞周期检测
        4.3.6 细胞凋亡检测
        4.3.7 细胞总RNA提取
        4.3.8 MicroRNA反转录PCR(Reverse Transcript PCR,RT-PCR)
        4.3.9 MicroRNA实时定量q RT-PCR(Quantitative Real Time PCR)
        4.3.10 m RNA反转录PCR(Reverse Transcript PCR,RT-PCR)
        4.3.11 m RNA实时定量q RT-PCR(Quantitative Real Time PCR)
        4.3.12 细胞转染
        4.3.13 双荧光素酶报告基因实验
        4.3.14 Western Blot蛋白免疫印迹实验
        4.3.15 数据统计分析
    4.4 实验结果
        4.4.1 X射线辐照显著诱导miR-16-5p的表达
        4.4.2 过表达miR-16-5p增强前列腺癌细胞的辐射敏感性
        4.4.3 敲低miR-16-5p增强前列腺癌细胞的辐射抗性
        4.4.4 过表达mi R-16-5p诱导前列腺癌细胞G0/G1 期的周期阻滞
        4.4.5 Cyclin D1/E1是mi R-16-5p的靶点
        4.4.6 Mi R-16-5p调节Cyclin D1/E1-p Rb-E2F1 信号通路
    4.5 讨论
第五章 前列腺癌细胞中MicroRNA-16-5p辐射应答的机制研究
    5.1 引言
    5.2 材料与试剂
        5.2.1 实验细胞
        5.2.2 主要试剂
        5.2.3 主要仪器
    5.3 实验方法和步骤
        5.3.1 细胞培养
        5.3.2 辐照处理
        5.3.3 细胞总RNA提取
        5.3.4 MicroRNA反转录PCR(Reverse Transcript PCR,RT-PCR)
        5.3.5 MicroRNA实时定量q RT-PCR(Quantitative Real Time PCR)
        5.3.6 m RNA反转录PCR(Reverse Transcript PCR,RT-PCR)
        5.3.7 m RNA实时定量q RT-PCR(Quantitative Real Time PCR)
        5.3.8 细胞转染
        5.3.9 Western Blot蛋白免疫印迹实验
        5.3.10 免疫共沉淀(Co-IP)实验
        5.3.11 数据统计分析
    5.4 实验结果
        5.4.1 X射线辐照对mi R-16-5p的转录即pri-mi R-16 的影响
        5.4.2 X射线辐照对mi R-16-5p的核内加工pre-mi R-16 的影响
        5.4.3 X射线辐照对miR-16-5p的核外加工成熟的影响
        5.4.4 X射线辐照对mi RNA生物合成关键蛋白的影响
        5.4.5 X射线辐照对前列腺癌细胞翻译后修饰的影响
        5.4.6 X射线辐照后p53与mi RNA加工蛋白Drosha结合
        5.4.7 构建p53敲除的稳定细胞株
        5.4.8 敲除p53影响miR-16-5p的辐射诱导表达
    5.5 讨论
第六章 结论与展望
参考文献
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果
    作者简历
    获奖情况
    参加的研究项目
    已发表(或正式接受)的学术论文



本文编号：3776672