肿瘤抑制因子p53与核受体辅激活因子SRC-1之间相互作用的研究

发布时间：2023-04-28 21:58

　　p53是一种肿瘤抑制因子,可以调节下游靶基因的转录活性,从而激活或抑制其转录。正是由于p53的这一功能,它需要与许多蛋白产生相互作用。涉及包括与细胞生长,存活,程序性细胞死亡等相关生命活动的基因的调控。SRC-1是一种核受体辅激活因子,参与染色质重塑,解凝,并对核受体转录调控起重要作用。由于SRC-1与核受体之间的相互作用使它在调控新陈代谢方面具有重要作用,例如控制脂肪生成,调控饱和脂肪酸储存,调节葡萄糖代谢等。为研究p53与SRC-1之间的相互作用,探索p53对SRC-1在体内表达是否具有某种调控作用并找出调控的方式。本研究通过分子克隆手段构建p53和SRC-1不同片段的表达载体,并通过Alpha Screen生化实验发现p53(5-293)和SRC-1(105-385)在体外存在相互作用,然后通过Pull Down实验,亲和层析实验进一步验证。体内细胞实验中,发现p53蛋白对SRC-1蛋白表达有抑制作用,通过蛋白合成抑制剂,蛋白酶体抑制剂和自噬抑制剂处理细胞,发现p53是通过某种泛素化酶对SRC-1进行转录后调控,使SRC-1蛋白被显著降解。接着通过免疫共沉淀和蛋白质印迹验证了它们...

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1. 前言
    1.1 p53的简介
        1.1.1 p53蛋白的功能结构域
        1.1.2 p53蛋白的信号通路
        1.1.3 p53蛋白的生物学功能
    1.2 SRC-1简介
        1.2.1 核受体简介
        1.2.2 核受体辅调节因子
        1.2.3 P160类固醇受体辅因子(SRC)基因家族
        1.2.4 SRC-1结构与功能
    1.3 泛素化途径
        1.3.1 泛素化
        1.3.2 p53与泛素化途径
        1.3.3 SRCs与泛素化途径
    1.4 研究的进展与意义
2. 材料与方法
    2.1 常用试剂与仪器
    2.2 细胞培养
        2.2.1 细胞株
        2.2.2 细胞常规培养
    2.3 分子克隆相关方法
        2.3.1 载体与质粒
        2.3.2 质粒构建
    2.4 融合蛋白的表达与纯化
        2.4.1 融合蛋白的表达
        2.4.2 融合蛋白的纯化
        2.4.3 聚丙烯凝胶电泳
    2.5 AlphaScreen分析实验
    2.6 Pull-Down实验
    2.7 免疫共沉淀Co-IP和蛋白印迹WB
        2.7.1 免疫共沉淀Co-IP
        2.7.2 Western Blot
3. 结果与分析
    3.1 肿瘤抑制因子p53及核受体辅激活因子SRC-1的片段截取
    3.2 p53和SRC-1融合蛋白的表达与纯化
        3.2.1 p53融合蛋白的表达与纯化
        3.2.2 SRC-1融合蛋白的表达与纯化
    3.3 p53和SRC-1体外相互作用的研究
        3.3.1 Alphascreen分析实验检测蛋白相互作用
        3.3.2 Pull Down实验检测蛋白相互作用
        3.3.3 共表达纯化实验验证SRC-1与p53的相互作用
        3.3.4 体外验证相互作用结果
    3.4 过表达p53可抑制SRC-1 PAS表达
    3.5 p53通过泛素化途径对SRC-1 PAS进行转录后调控
        3.5.1 在阻断蛋白合成途径后,p53加速SRC-1 PAS降解
        3.5.2 泛素化途径的阻断回调p53对SRC-1 PAS的抑制作用
    3.6 Co-IP实验验证p53与SRC-1 PAS相互作用
4. 讨论
参考文献
致谢



本文编号：3804560