硒蛋白TrxR1介导甲萘醌还原：催化特性和抑制作用

发布时间：2024-01-14 13:16

　　硫氧还蛋白还原酶(Thioredoxin reductase,TrxR)是一类重要的抗氧化硒蛋白,参与调控肿瘤发生发展。研究表明,萘醌类分子可以靶向抑制TrxR1活性并经由TrxR1介导产生活性氧,导致细胞氧化还原失衡,使其成为潜在的肿瘤化疗药物。本文旨在通过生物化学及质谱分析,探究硒蛋白TrxR1与萘醌化合物甲萘醌的相互作用,进一步揭示TrxR1催化萘醌分子还原的机理和萘醌分子抑制TrxR1活性的机制。通过对TrxR1催化残基的定点突变和突变体的重组表达,我们测定TrxR1突变体介导甲萘醌还原稳态动力学参数,并分析甲萘醌对TrxR1活性抑制,最后通过质谱分析鉴定甲萘醌与TrxR1相互作用。结果表明,硒蛋白TrxR1的Sec498催化甲萘醌还原,但是U498C突变使甲萘醌还原更加高效,表明了甲萘醌还原主要呈现非硒依赖性。突变实验发现C端Cys498发挥主要催化还原作用,而N端Cys64对甲萘醌还原的影响稍强于Cys59。LC-MS结果发现TrxR1存在1分子甲萘醌加合物,推测其不可逆修饰硒蛋白C末端高反应活性的硒代半胱氨酸。本研究揭示了TrxR1可以非硒依赖方式催化甲萘醌还原,同时其活...

【文章页数】：12 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料与仪器
    1.2 重组大鼠Trx R1定点突变体的质粒构建
    1.3 Trx R1及突变体蛋白的表达
    1.4 Trx R1及突变体蛋白的纯化
    1.5 Trx R1突变体蛋白浓度测定
    1.6 Trx R1及突变体蛋白的电泳分析
    1.7 以甲萘醌为底物的稳态反应动力学分析
    1.8 甲萘醌抑制Trx R1活力测定
    1.9 LC/MS分析
2 结果与分析
    2.1 重组大鼠Trx R1活性位点突变
    2.2 重组大鼠Trx R1突变体蛋白的制备
    2.3 Trx R1及其突变体的活性检测
    2.4 以甲萘醌为底物的稳态反应动力学检测
    2.5 Trx R1位点突变检测甲萘醌还原反应
    2.6 GR还原甲萘醌的稳态反应动力学检测
    2.7 甲萘醌对Trx R1的抑制作用
    2.8 甲萘醌对Trx R1靶向结合的质谱分析
3 讨论



本文编号：3878300