利用电转的方法对T细胞TET2基因敲除并探讨TET2对T细胞增殖的影响

发布时间：2024-03-02 10:11

　　近年来,利用重组病毒对T细胞进行基因编辑用于免疫治疗,受到了广泛重视。然而,重组病毒因存在随机整合,制备耗时长且昂贵的缺点制约了其应用。与此同时,电转染技术的应用能够快速将外源DNA带入细胞内,有助于提高T细胞基因编辑效率。TET(Ten-eleven translocation)家族蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶(5mC)转化为5-羟甲基胞嘧啶(5hmC),5hmC作为细胞中的DNA去甲基化酶,在细胞基因组表观遗传学中起着重要调控作用。研究表明TET2基因的缺失能够促进CAR-T细胞的快速繁殖,产生强力的CAR-T细胞。该研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对TET2基因进行敲除。首先对sgRNA进行体外转录,与大肠杆菌诱导表达的Cas9蛋白孵育形成Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP),并在体外酶切验证sgRNA的活性。接着利用电转染技术将Cas9:gRNA核糖核蛋白复合物(RNP)带入细胞内,并检测T细胞基因编辑效率。最后利用流式细胞分析技术检测T细胞的增殖情况。基因测序与T7EⅠ酶切结果表明,T细胞中的TET2基因被成功敲除,T细胞活力和功能并未受到影响。流式细胞技术,...

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【部分图文】：

图4T细胞TET2基因敲除验证

本研究构建了携带有核定位信号的Cas9蛋白表达载体，在大肠杆菌蛋白表达系统中诱导Cas9蛋白表达。由于大肠杆菌蛋白表达系统均有操作方便快捷、时间周期短、获得蛋白量大等特点，能够在短时间内获得大量的Cas9蛋白。人为在Cas9蛋白C端融合表达了6个组氨酸，His标签能够特异性的与N....

图5台盼蓝计数检测细胞增殖

图4T细胞TET2基因敲除验证图6CCK-8细胞计数检测细胞活力

图1Cas9蛋白表达与纯化

PBMC中分离纯化的T细胞在电转染2d内，细胞由于电穿孔损伤会使部分细胞死亡，活细胞数量统计显示死亡率为42.1%，在培养基中加入IL-2、CD28等细胞因子的刺激下T细胞培养2d后开始增殖。之前研究表明T细胞在体外生长一段时间，随着时间的延长T细胞会逐渐死亡。在T细胞中敲除....

图2Cas9和gRNA体外酶切活性鉴定

T淋巴细胞作为人体细胞免疫的重要成分，T细胞在淋巴细胞中数量最多，其由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，为功能最复杂的一类细胞。T细胞行使正常功能对人类抵御疾病非常重要，2012年美国科学家以HIV病毒为载体将T细胞进行改造使其可以杀伤人体内白血病细胞。CAR-T免疫细胞治疗主要以慢病....

本文编号：3916719