异牛肝菌素对人肺腺癌A549细胞的抑制作用及其机制研究

发布时间：2017-05-27 13:24

  本文关键词：异牛肝菌素对人肺腺癌A549细胞的抑制作用及其机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:近年来,随着环境污染和人口老龄化等因素,全球癌症患者和死亡病例不断增加,并呈逐年迅猛增长态势。在所有的癌症中,肺癌仍是最普遍和最致命的恶性肿瘤,每年全球肺癌新增病例约180万,占全球所有癌症新增病例的13%;每年约有160万人死于肺癌,占全球癌症死亡病例的20%;肺癌患者的5年生存率不到15%。在中国肺癌的发病率和死亡率一直居于首位,约占全世界肺癌病例的1/3以上。目前,临床上对癌症的治疗效果依然处在相对较低的水平,常用化疗药物的效能因其一系列的副反应而受限,因此,寻找或合成更为安全有效的抗肿瘤药物依然是摆在医药工作者面前的迫切任务。在很久以前真菌就有作为药物的记载。有很多真菌类的代谢产物表现出明显的抗肿瘤、抗氧化、抗感染和消炎止痛等作用。一些研究资料表明,天然植物和真菌类含有丰富的酚类化合物,其中部分化合物表现出了很高的生物活性。异牛肝菌素(iso-suillin)属于异戊二烯基酚类化合物,从乳牛肝菌(Suillus flavus)中分离得到。通过筛选和研究发现,iso-suillin表现出了较强的生物活性,能够在体外有效抑制肿瘤细胞的生长,诱导细胞周期阻滞和凋亡;与顺铂(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)比较,iso-suillin表现出了更强的抑瘤作用,并且对正常人的淋巴细胞没有毒性。在以前研究的基础上,本研究致力于通过对肺腺癌A549细胞的体外实验和裸鼠移植瘤实验来进一步探讨iso-suillin的抗肿瘤作用及机制。方法:1细胞培养A549细胞以RPMI 1640培养基,含10%FBS、青霉素100U/m L、链霉素100μg/m L,置于37℃、5%CO_2的饱和湿度培养箱中培养。2 MTS法检测不同浓度iso-suillin处理后A549细胞体外增殖活性并绘制细胞增殖抑制曲线。3流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡率收集细胞后用预冷的PBS洗1次,离心弃上清,分别用1×Banding buffer重悬细胞,使其终浓度为1×106cells/m L,取100 u L,加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI solution,室温下避光染色15 min,Epics-XLII流式细胞仪检测,绘制直方图并计算出G0/G1、S、G2/M期分布百分比及早期和晚期凋亡率。4.Iso-suillin对裸鼠的药物毒性实验选取6只6~8周龄雌性裸鼠,皮下注射给药,持续2周观察裸鼠生活状态及体重情况。5 Iso-suillin抑制裸鼠移植瘤增殖实验挑选肿瘤大小为90~110 mm3的裸鼠,随机分成两组,分别用生理盐水和iso-suillin稀释液瘤旁皮下注射给药,隔天注射一次,观察两周,记录小鼠体重和肿瘤大小。肿瘤体积按照以下公式来计算:肿瘤体积=长径×短径2/2。6移植瘤组织包埋、切片及HE染色裸鼠肿瘤组织块取出后放入10%中性甲醛中固定48 h以上,取出后将肿瘤组织切成约3 mm厚度,常规包埋和切片,HE染色,封片后镜下观察拍照。7移植瘤组织切片TUNEL法检测凋亡组织切片脱蜡后参照TUNEL法操作步骤进行染色后荧光显微镜下观察拍照。8细胞形态学观察对数生长期的A549细胞以1×105 cells/m L浓度接种于24孔板中,用不同浓度的iso-suillin处理24 h,PBS洗一遍后用倒置相差显微镜观察拍照;然后将细胞用4%多聚甲醛固定15 min,用1%Triton X-100透膜5 min,加入DAPI(5μg/m L)染色,荧光显微镜下记录其细胞核形态。9线粒体膜电位检测对数生长期的A549细胞以不同浓度的iso-suillin处理后进行JC-1染色,荧光显微镜下观察拍照。10蛋白质免疫印记(Western Blot)技术检测相关蛋白的表达对数生长期的A549细胞经不同浓度的iso-suillin处理后提取细胞总蛋白,经蛋白定量后进行Western Blot检测DNA损伤,细胞周期和凋亡及p53信号通路相关蛋白的表达。11统计方法实验结果以(?)±s表示,用SPSS 13.0统计软件作单因素方差分析(One-Way ANOVA),取P0.05为有统计学差异。结果:1 Iso-suillin在体外对A549细胞增殖活性的影响A549细胞的增殖活性随着iso-suillin浓度的增高和给药时间的延长而降低。不同浓度iso-suillin处理A549细胞6、12、24、48和72 h后,其半数抑制浓度IC50值分别为80.86、39.40、11.56、1.43和0.43μM。实验结果表明,iso-suillin对体外培养的A549细胞具有明显的抑制作用,且具有浓度和时间依赖性。2 Iso-suillin对裸鼠及A549细胞移植瘤生长的影响经过不同浓度iso-suillin皮下注射后未发现裸鼠的异常情况,裸鼠的饮食与体重增加情况与空白组比较没有明显差异。A549细胞裸鼠移植瘤成瘤率为100%,接种后第14 d,移植瘤体积生长至约100 mm3。第1、5、9、13和17 d,对照组的裸鼠体重(g)分别为16.98±0.35、17.13±0.30、17.16±0.54、18.29±0.55和19.18±1.21;对照组移植瘤体积(mm3)分别为89.38±15.30、125.68±8.83、220.38±48.63、311.16±93.67和600.91±133.03;实验组裸鼠体重分别为17.12±0.36、17.13±0.38、17.58±0.61、18.46±1.15和19.62±0.83,实验组移植瘤体积分别为93.06±17.79、128.89±12.97、205.70±34.75、310.57±87.93和383.36±107.11。在第17 d,实验组与对照组比较,裸鼠体重之间无显著性差异(P0.05),移植瘤体积之间具有显著性差异(P0.05)。3 Iso-suillin对A549细胞周期分布及凋亡率的影响A549细胞经0、3.12、6.25和12.5μM iso-suillin处理24 h后,G0/G1期细胞比例为44.8±2.17%、58.5±1.98%、59.3±1.76%、55.1±2.62%;S期细胞分别为46.9±2.23%、28.1±1.74%、27.8±3.02%、31.7±2.38%;G2/M期细胞分别为8.3±3.12%、13.4±2.56%、15.9±2.48%、13.2±1.56%。即随着处理药物浓度的增加G0/G1期细胞所占比例增加(P0.05)。A549细胞早期凋亡比例为3.16±0.0812%、9.71±1.25%、40.88±5.26%和39.35±4.56%,晚期凋亡比例为0.65±0.09%、3.07±1.32%、14.83±1.25%和18.43±2.35%,药物处理组早期凋亡较对照组升高,具有明显差异(P0.05);晚期凋亡较对照组升高明显,具有浓度依赖性(P0.05)。4 Iso-suillin对A549细胞形态的影响不同浓度iso-suillin处理A549细胞24 h后,分别通过倒置相差显微镜在可见光下观察和利用DAPI染色后在倒置荧光显微镜下观察细胞的变化及凋亡的形态特征。在可见光下观察对照组细胞较多,贴壁牢固,个体状态饱满,细胞膜完整,呈梭形或多边形,而实验组细胞数目明显减少,细胞开始脱离底壁,缩成圆形,细胞膜出泡,细胞裂解成很多凋亡小体分散开来;在荧光显微镜下观察,对照组的细胞核界限清晰,呈圆形或者椭圆形,细胞核内部蓝色荧光均匀分布,偶可见分裂像的细胞核,而iso-suillin处理后的部分A549细胞,核开始缩小,染色质分布不均匀,呈现凝集,核碎裂形成许多球形颗粒。5 Iso-suillin对移植瘤组织切片中细胞形态的影响裸鼠移植瘤经过常规HE染色后,在显微镜下进行观察的结果:对照组的细胞形态完整,细胞核清晰可见,着色均匀,部分呈现分裂像,偶可见着色较深的染色体,细胞分裂旺盛;处理组移植瘤组织切片中的细胞胞浆浓缩,核固缩,着色较深,细胞膜不完整,可见肿瘤细胞坏死。组织切片经过TUNEL染色后再由DAPI复染,放置在荧光显微镜下观察,在相同的曝光时间下,对照组细胞核清晰可见,DNA均匀完整,TUNEL染色后代表DNA断裂的绿色荧光亮度非常微弱,而实验组细胞出现核固缩,DNA呈弥散状态,TUNEL染色后细胞内的绿色荧光很强,说明药物处理后移植瘤内细胞出现大面积的细胞DNA断裂,表明iso-suillin能够阻碍移植瘤内细胞增殖,诱导裸鼠移植瘤细胞坏死或凋亡。6 Iso-suillin对A549细胞线粒体膜电位的影响iso-suillin处理A549细胞后,利用JC-1染色后在荧光显微镜下观察,通过分析绿色和红色荧光强度的比值来反应线粒体膜电位变化,结果显示,线粒体膜电位的降低与药物浓度呈量效关系,线粒体膜电位随药物浓度升高而降低。7 Iso-suillin对A549细胞周期,凋亡及p53信号通路相关蛋白的影响A549细胞经不同浓度iso-suillin处理后,Western Blot检测相关蛋白的表达水平,结果如下:与β-actin蛋白比较,caspase-8蛋白的IOD比值分别为:0.17±0.04、0.21±0.04、0.30±0.05和0.45±0.07;caspase-9蛋白的IOD比值分别为0.14±0.03、0.37±0.05、0.41±0.07和0.64±0.06;pro-caspase-3蛋白的IOD比值分别为0.48±0.06、0.46±0.08、0.44±0.05和0.38±0.06;cleaved caspase-3蛋白的IOD比值分别为0.02±0.01、0.03±0.01、0.08±0.02和0.15±0.04;Bax蛋白的IOD比值分别为:0.43±0.05、0.57±0.03、1.56±0.04和2.83±0.14;Bcl-2蛋白的IOD比值分别为:0.16±0.03、0.14±0.04、0.09±0.02和0.07±0.02;p27蛋白的IOD比值分别为0.13±0.04、0.42±0.09、0.87±0.12和0.93±0.10;cyclin D1蛋白的IOD比值分别为1.42±0.11、0.87±0.09、0.43±0.04和0.08±0.03;CDK4蛋白的IOD比值分别为0.43±0.05、0.37±0.06、0.38±0.07和0.29±0.06;E2F-1蛋白的IOD比值分别为0.27±0.04、0.24±0.03、0.04±0.02和0.02±0.02;γ-H2AX蛋白的IOD比值分别为0.04±0.02、0.08±0.03、0.25±0.04和0.56±0.09;p53(phospho S20)蛋白的IOD比值分别为0.02±0.01、0.03±0.01、0.09±0.04和0.20±0.08;p53(phospho S15)蛋白的IOD比值分别为0.04±0.02、0.09±0.04、0.16±0.05和0.34±0.09;野生型p53蛋白的IOD比值分别为0.48±0.07、0.35±0.08、0.12±0.04和0.03±0.01。结果显示:与对照组细胞相比,经iso-suillin处理后的A549细胞中cleaved caspase-3、caspase-8、caspase-9、Bax、p27、γ-H2AX、p53(phospho S20)、p53(phospho S15)蛋白表达量增高,具有显著性差异(P0.05);Bcl-2、E2F-1、p53、cyclin D1蛋白表达量降低,具有显著性差异性(P0.05);pro-caspase 3和CDK4蛋白表达量略微下降,无显著性差异(P0.05)。结论:1.Iso-suillin能够在体外抑制A549细胞的增殖并诱导细胞凋亡。2.Iso-suillin能够抑制A549细胞裸鼠移植瘤生长并诱导肿瘤细胞坏死,而对裸鼠没有明显药物毒性。3.Iso-suillin能够诱导A549细胞发生G0/G1期阻滞。4.Iso-suillin能够导致A549细胞产生DNA损伤。5.Iso-suillin可以通过p53信号通路诱导A549细胞周期阻滞和凋亡。
【关键词】：异牛肝菌素 A549细胞 G0/G1期阻滞 凋亡 裸鼠移植瘤 p53 DNA损伤
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 前言15-16
• 材料与方法16-26
• 结果26-29
• 附图29-40
• 附表40-42
• 讨论42-45
• 结论45-46
• 参考文献46-49
• 综述 异戊二烯基酚类化合物的研究进展49-62
• 参考文献57-62
• 致谢62-63
• 个人简历63

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本文编号：400108