岗田酸联合顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

发布时间：2017-06-07 22:03

  本文关键词：岗田酸联合顺铂对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景:过去三十年,我国肺癌患者死亡率大幅度攀升。未来十年,我国肺癌病人数可能成为世界第一,肺癌的预防和治疗刻不容缓。传统上肺癌的治疗分为:化学治疗、放射治疗和外科治疗。其中,化疗为90%以上肺癌患者需接受的治疗方法,临床上顺铂是最常用的化疗药物。近年以来,随着受体化疗耐药性的增强,铂类化疗效果不理想。故寻找高效、低毒的药物来联合顺铂以增强化疗效果。本文选取海洋藻毒素岗田酸与传统老药顺铂,探讨两药单独及联合对人肺腺癌A549细胞增殖的影响,分析两药相互作用关系并初步探究诱导细胞凋亡的机制,以期为寻找临床化疗调节剂提供新的理论依据。研究方法:1.MTT法检测细胞增殖抑制率,分析顺铂、岗田酸及两药联合对A549细胞增殖的影响。金正均公式分析岗田酸与顺铂两药在抑制A549细胞增殖上的相互关系。2.台盼蓝拒染实验进行活细胞数量的测定,透射电镜观察、倒置相差显微镜观察、Giemsa染色法、吖啶橙染色法观察药物对A549细胞形态学影响。3.琼脂糖凝胶电泳法、考马斯亮蓝G250染色法检测药物对A549细胞遗传物质DNA和胞内蛋白的影响。4.荧光分光光度法测定ROS含量和线粒体去极化,倒置相差荧光显微镜观察线粒体膜电位变化,MTT检测外源Ca2+对药物处理下A549细胞存活率的影响。研究结果:1.MTT实验结果显示:一定浓度范围内,岗田酸和顺铂对A549细胞的增殖均存在抑制作用,抑制作用随着时间延长和剂量升高而加强。双药联合对细胞增殖产生抑制,抑制效果好于单药作用,联合作用也呈现出时间和剂量依赖性抑制。金正均公式计算结果显示:岗田酸联合顺铂处理A549细胞,岗田酸与顺铂表现出相加或协同的作用效果。2.台盼蓝拒染实验结果显示:经20ng/ml岗田酸、1μg/ml顺铂、20ng/ml岗田酸+1μg/ml顺铂处理A549细胞后,活细胞数目呈现时间依赖性减少,双药联合作用效果明显好于单药。形态学观察结果显示:20ng/ml岗田酸、1μg/ml顺铂、20ng/ml岗田酸+1μg/ml顺铂处理A549细胞48h后,细胞间接触消失,细胞形态变圆,细胞体积缩小,细胞内染色质凝集,细胞空泡化严重,细胞周围密布凋亡小体、部分细胞破碎解体,双药联合细胞凋亡现象比单药更严重。3.琼脂糖凝胶电泳结果显示:20ng/ml岗田酸、1μg/ml顺铂、20ng/ml岗田酸+1μg/ml顺铂处理A549细胞48h后,DNA受损出现阶梯状光亮条带,联合处理组DNA条带更长、更亮,说明药物作用下A549细胞发生凋亡。考马斯亮蓝G250染色结果显示:药物作用下A549细胞内总蛋白含量降低,药物联合处理组蛋白含量是低于顺铂处理组和岗田酸处理组,联合处理组与对照相比具有显著性差异。4.药物引起A549细胞凋亡可能是通过ROS、Ca2+、线粒体参与的胞内信号通路。实验结果显示:药物作用下细胞内ROS含量升高,添加外源Ca2+能加剧细胞凋亡,线粒体膜电位有显著性的变化。
【关键词】：岗田酸 顺铂 A549细胞 联合 细胞增殖 细胞凋亡
【学位授予单位】：曲阜师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 第一部分 前言10-13
• 1.1 研究背景10-11
• 1.1.1 肺癌的危害和现状10
• 1.1.2 肺癌的治疗及前景10-11
• 1.2 研究的目的和意义11-13
• 第二部分 实验仪器与试剂13-15
• 2.1 实验材料13
• 2.1.1 实验采用的细胞系13
• 2.1.2 实验药物13
• 2.2 主要的药品13
• 2.3 主要的实验仪器13-15
• 第三部分 基础准备实验15-19
• 3.1 准备实验15-17
• 3.2 基础实验17-19
• 3.2.1 细胞复苏17
• 3.2.2 细胞传代17-18
• 3.2.3 细胞冻存18-19
• 第四部分MTT实验检测单药及双药联合对A549细胞增殖影响19-28
• 4.1 药品的配制19-20
• 4.1.1 顺铂的配制19
• 4.1.2 岗田酸的配制19
• 4.1.3 MTT工作液19-20
• 4.2 实验方法20-21
• 4.2.1 MTT实验检测顺铂对A549细胞增殖抑制率20
• 4.2.2 MTT实验检测岗田酸对A549细胞增殖抑制率20
• 4.2.3 MTT实验检测岗田酸联合顺铂对A549细胞增殖抑制率20-21
• 4.3 实验结果21-27
• 4.3.1 MTT实验检测顺铂对A549细胞增殖抑制率21-23
• 4.3.2 MTT实验检测岗田酸对A549细胞增殖抑制率23-24
• 4.3.3 MTT实验检测岗田酸联合顺铂对A549细胞的增殖抑制率24-27
• 4.4 讨论与分析27-28
• 第五部分 药物作用下A549细胞数量及显微形态的变化28-36
• 5.1 药品的配制28
• 5.1.1 台盼蓝染液28
• 5.1.2 Giemsa染液28
• 5.1.3 吖叮橙染液28
• 5.2 实验方法28-30
• 5.2.1 台盼蓝染色检测药物作用下A549细胞数量的变化28-29
• 5.2.2 倒置相差显微镜下观察药物作用下A549细胞形态变化29
• 5.2.3 Giemsa染色观察A549细胞在药物处理下的形态变化29
• 5.2.4 吖叮橙染色观察A549细胞在药物处理下的核形态变化29-30
• 5.3 实验结果30-35
• 5.3.1 台盼蓝染色检测药物作用下A549细胞数量的变化30
• 5.3.2 倒置相差显微镜下观察药物作用下A549细胞形态变化30-32
• 5.3.3 Giemsa染色观察A549细胞在药物处理下的形态变化32-33
• 5.3.4 吖叮橙染色观察A549细胞在药物处理下的核形态变化33-35
• 5.4 分析与讨论35-36
• 第六部分 药物联合作用对A549细胞亚显微结构的影响36-39
• 6.1 实验方法36
• 6.2 实验结果36-38
• 6.2.1 细胞全貌变化36-37
• 6.2.2 细胞膜及核变化37-38
• 6.3 讨论与分析38-39
• 第七部分 药物联合作用下A549细胞遗传物质DNA的变化39-44
• 7.1 药品的配制39-41
• 7.1.1 蛋白酶K（10mg/ml）39
• 7.1.2 乙酸钠（NaAc, 3mol/l）39
• 7.1.3 Rnase（10mg/ml，无Dnase）39
• 7.1.4 10% SDS39-40
• 7.1.5 EDTA（0.5mol/l, PH=8.0）40
• 7.1.6 TE缓冲液（PH=8.0）40
• 7.1.7 50×TAE缓冲液40-41
• 7.1.8 6×Loading Buffer41
• 7.1.9 DNA裂解液41
• 7.2 实验方法41-42
• 7.3 实验结果42-43
• 7.4 讨论与分析43-44
• 第八部分 药物作用下A549细胞总蛋白含量的变化44-48
• 8.1 药品的配制44-45
• 8.1.1 PMSF（10mmol/l）44
• 8.1.2 细胞裂解液44
• 8.1.3 考马斯亮蓝G250染液44
• 8.1.4 0.1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）44-45
• 8.2 实验方法45-46
• 8.2.1 细胞总蛋白的提取45
• 8.2.2 蛋白含量的测定45-46
• 8.3 实验结果46-47
• 8.3.1 蛋白标准曲线46
• 8.3.2 药物作用后细胞总蛋白的检测46-47
• 8.4 讨论与分析47-48
• 第九部分 药物作用下细胞凋亡机制探讨48-56
• 9.1 药品配制48-49
• 9.1.1 Rhodamine 12348
• 9.1.2 外源Ca2+48-49
• 9.2 实验方法49-50
• 9.2.1 活性氧试剂盒检测细胞内活性氧水平49
• 9.2.2 外源型Ca2+对药物作用下A549细胞凋亡的影响49-50
• 9.2.3 Rhodamine 123检测线粒体膜电位的变化50
• 9.2.4 Jc-1 试剂盒检测线粒体去极化50
• 9.3 实验结果50-54
• 9.3.1 活性氧试剂盒检测细胞内活性氧水平50-51
• 9.3.2 外源型Ca2+对药物作用下A549细胞凋亡的影响51-53
• 9.3.3 Rhodamine 123检测线粒体膜电位的变化53-54
• 9.3.4 Jc-1 试剂盒检测线粒体去极化54
• 9.4 讨论与分析54-56
• 第十部分 结论与展望56-57
• 10.1 结论56
• 10.2 展望56-57
• 附录57-58
• 参考文献58-64
• 致谢64

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