UC-MSCs条件培养基对HepG2影响的miRNAs差异表达谱分析及miR-3065-5p功能的初步探讨

发布时间：2017-06-08 00:02

  本文关键词：UC-MSCs条件培养基对HepG2影响的miRNAs差异表达谱分析及miR-3065-5p功能的初步探讨，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类多潜能成体干细胞,广泛存在于动物胎儿和成体多种组织器官中,例如：脂肪、软骨、骨髓、羊水、脐带和胎盘等。MSCs可以向肿瘤归巢,参与肿瘤基质形成,通过分泌一些细胞因子影响肿瘤细胞的增殖、迁移和肿瘤血管的形成,并且能够改变肿瘤内源性miRNAs的表达水平,进而影响肿瘤细胞的生物学行为。课题组前期研究发现,一定浓度的UC-MSCs条件培养基能够抑制肝癌HepG2的增殖。为深入了解其分子机制,我们首先对UC-MSCs条件培养基处理HepG2不同时间(1h、6h、12h、24h)后的4个处理组和对照组HepG2(Oh)样本进行Small RNAs高通量测序,构建了miRNAs差异表达谱。结果显示：从对照组到处理组的5组cDNA文库中,分别获得1091、1079、1164、1086和1193万余条干净序列；与基因组比对发现,每组样本均达到67%以上的基因组覆盖率；进一步与miRBase数据库比对发现,5组样本分别检测出942,995,1031,976和958种miRNAs成熟体。另外,处理组与对照组比对差异表达miRNAs数目表明,随着条件培养基处理时间的延伸,差异表达的miRNAs数目逐步增多,miRNAs的表达始终处于持续变化的状态。此外,为了验证测序结果的可靠性,用qRT-PCR方法对10个差异表达的miRNAs进行了验证,结果显示,miRNAs的表达趋势与测序结果基本一致。其次,采用TargetScan软件预测了差异表达miRNAs的可能靶基因,并对这些靶基因进行GO功能和KEGG信号通路注释。结果显示：这些差异表达miRNAs的候选靶基因主要集中在细胞转录调控、细胞增殖、凋亡和信号转导等生物学功能中；这些候选靶基因显著富集于多条信号通路中,例如：MAPK信号通路、Wnt信号通路、钙离子信号通路、单纯疱疹感染和氨基糖代谢等通路；这提示UC-MSCs条件培养基确实会影响HepG2细胞的生理生化相关信号通路。再次,为更好地阐明UC-MSCs条件培养基抑制HepG2增殖的分子机理,我们将HepG2细胞的Small RNAs数据与前期实验室分析该样本转录组数据进行关联分析。结果发现：上调miRNAs与下调mRNAs之间的互作调控模式有12条；下调miRNAs与上调mRNAs之间的互作调控模式有5条。例如：输出数据中,差异倍数较大的miR-375负调控基因ARHGAP21和JUND的表达,表达丰度较高的let-7f-3p和miR-34a-3p协同抑制因子IL6的表达。最后,筛选出增殖条目下的差异表达miR-3065-5p进行功能验证,体外实验证实,过表达miR-3065-5p可以显著抑制HepG2细胞的增殖和侵袭,说明miR-3065-5p是一个潜在的肿瘤抑制miRNA。此外,miR-3065-5p过表达可降低HepG2细胞中的SATB1的表达,可推测SATB1极有可能是miR-3065-5p的靶基因。
【关键词】：UC-MSCs条件培养基 HepG2 miRNAs表达谱 功能验证
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 符号说明10-11
• 第一章 miRNAs在肝癌发病中的作用(文献综述)11-16
• 1.1 miRNAs的概述11-12
• 1.2 miRNAs在肝癌发病中的作用12-15
• 1.2.1 miRNAs在肝癌发病中的基础研究12-14
• 1.2.2 miRNAs在肝癌发病中的临床研究14-15
• 1.3 结论与展望15-16
• 第二章 HepG2细胞系Small RNAs高通量测序及全局分析16-38
• 2.1 实验材料16-17
• 2.1.1 细胞材料16
• 2.1.2 主要试剂与药品16-17
• 2.1.3 主要仪器设备17
• 2.2 实验方法17-23
• 2.2.1 细胞培养基配制17
• 2.2.2 HepG2和UC-MSCs培养17-19
• 2.2.2.1 细胞复苏17-18
• 2.2.2.2 细胞传代并铺板18
• 2.2.2.3 UC-MSCs条件培养基处理HepG2细胞18
• 2.2.2.4 总RNA提取18-19
• 2.2.2.5 RNA纯化19
• 2.2.3 HepG2细胞系RNA样本的质量检测19
• 2.2.4 HepG2细胞系cDNA文库制备及高通量测序19-20
• 2.2.5 HepG2细胞系Small RNAs测序数据输出及全局分析20-23
• 2.2.5.1 Small RNAs测序数据的输出20
• 2.2.5.2 已知miRNAs鉴定20-21
• 2.2.5.3 miRNAs差异表达分析21
• 2.2.5.4 qRT-PCR验证21-22
• 2.2.5.5 miRNAs候选靶基因GO功能注释分析22
• 2.2.5.6 miRNAs候选靶基因KEGG信号通路注释分析22-23
• 2.2.5.7 肝癌HepG2细胞系miRNAs与mRNAs数据关联分析23
• 2.3 结果与分析23-35
• 2.3.1 HepG2细胞系RNA样本质量检测结果23-24
• 2.3.2 HepG2细胞系Small RNAs高通量测序及全局分析24-35
• 2.3.2.1 Small RNAs测序数据的输出统计24
• 2.3.2.2 已知miRNAs鉴定结果24-25
• 2.3.2.3 miRNAs差异表达分析结果25-27
• 2.3.2.4 qRT-PCR验证结果27-28
• 2.3.2.5 miRNAs候选靶基因GO功能注释分析结果28-30
• 2.3.2.6 miRNAs候选靶基因KEGG信号通路注释分析结果30-34
• 2.3.2.7 差异表达miRNAs与mRNAs关联分析结果34-35
• 2.4 讨论35-37
• 2.5 结论37-38
• 第三章 miR-3065-5p对HepG2的生物学行为的影响38-47
• 3.1 实验材料38
• 3.1.1 主要试剂与耗材38
• 3.1.2 主要仪器设备38
• 3.2 实验方法38-40
• 3.2.1 细胞培养与转染39
• 3.2.2 细胞增殖能力检测39
• 3.2.3 细胞侵袭能力检测39-40
• 3.2.4 细胞周期检测40
• 3.2.5 细胞凋亡检测40
• 3.2.6 靶基因表达水平检测40
• 3.3 实验结果40-45
• 3.3.1 miRNA agomir转染效果验证40-41
• 3.3.2 细胞增殖能力检测结果41-42
• 3.3.3 细胞侵袭能力检测结果42-43
• 3.3.4 细胞周期检测结果43
• 3.3.5 细胞凋亡检测结果43-44
• 3.3.6 靶基因表达水平检测结果44-45
• 3.4 讨论45-46
• 3.5 结论46-47
• 参考文献47-56
• 附录56-63
• 攻读学位期间取得的研究成果63-64
• 致谢64

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