MiRNA-17-92影响肝癌干细胞特性及在肝脏损伤中的作用

发布时间：2017-06-14 17:24

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【摘要】：Micro RNA-17-92基因簇目前研究最多的mi RNA簇,其成员包括mi R-17、mi R-18a、mi R-19a、mi R-19b-1、mi R-20a和mi R-92a-1,参与到包括器官发育、物质代谢、细胞增殖分化、凋亡和癌变等生物体生命过程的各个环节。本研究重点探讨micro RNA-17-92对肝癌细胞无血清悬浮培养成球能力、增殖、迁移、凋亡和皮下移植瘤形成等干细胞特性的影响,以及在体内、外化学性和药物性肝细胞损伤中的作用。一、Micro RNA-17-92基因簇对肝癌细胞干细胞特性的影响肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)位居世界肿瘤发病率第五位,肿瘤死亡率第三位。已经明确的HCC高危因素是超重和糖尿病,区域性的乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)爆发也与HCC的发病相关。最新报道发现的高危因素还包括高龄、酗酒、黄曲霉毒素(aflatoxin)暴露、铁元素相关的血色素沉着,还有吸烟,但具体机制还不明确。肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs),又称肿瘤启动细胞(tumor-initiating cells,T-ICs)是肿瘤组织中的一小群干细胞样细胞,具有自我更新和多向分化潜能,是肿瘤复发转移的重要因素。近年来,CD133,CD90,Ep CAM,CD24,CD47等多个肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)表面标志物被鉴定,它们的高表达对于维持肝癌干细胞的自我更新、体内成瘤、迁移、耐药等特性至关重要,并与肝癌患者的预后密切相关。在前期研究中我们利用DEN诱发小鼠肝癌组织mi RNA表达谱,发现HPPCn转基因小鼠肝癌组织与癌旁组织比较,mi R-17-92在肝癌组织中的表达显著上调。随后我们检测了10例人肝细胞癌组织中mi R-17-92的表达,结果显示mi R-17-92在人肝癌组织中表达明显增加。本研究利用慢病毒介导的基因表达建立mi R-17-92稳定高表达的肝癌细胞和利用mi RNA inhibitor转染抑制mi R-17-92的表达的方法,评价其对肿瘤干细胞生物学特性的影响,为mi R-17-92基因簇参与HCC调控寻找新的突破。本研究发现mi R-17-92基因簇可以促进肝癌细胞干细胞特性,主要表现在以下几方面:1)Mi R-17-92过表达促进肝癌细胞自我更新能力:无血清悬浮培养可以通过形成肿瘤干细胞球的数目和大小,实现从单个细胞的水平评价CSC自我更新的能力。对mi R-17-92稳定高表达的肝癌细胞系(97L-17-92OE)和对照细胞系(97L-NTC)的悬浮培养发现,接种97L-17-92OE细胞4天左右,镜下即可观察到干细胞球,培养至1周以上,97L-17-92OE细胞中干细胞球数量明显多于对照组,且干细胞球体积大,结构紧实,轻拍培养皿不分散;2)Mi R-17-92过表达促进肝癌细胞的迁移能力:利用含5%血清的DMEM作为迁移诱导液,诱导97L-17-92OE细胞和对照97L-NTC细胞的迁移,97L-17-92OE细胞迁移数量远多于97L-NTC细胞;3)Mi R-17-92过表达促进肝癌细胞对sorafenib的耐药:Annexin-V细胞凋亡实验结果显示,mi R-17-92过表达显著增加了肝癌细胞对Sorafenib的耐药能力;4)抑制mi R-17-92表达能够抑制肝癌细胞的增殖:Mi RNA Inhibitor抑制mi R17-92各成员的表达后,肝癌LM3细胞的增殖能力降低;5)抑制mi R-17-92表达抑制了肝癌细胞的迁移:利用含5%血清的DMEM作为迁移诱导液,诱导抑制mi R-17-92各成员表达后的LM3细胞迁移,抑制表达后的LM3迁移数少于正常LM3细胞;6)抑制mi R-17-92表达抑制了肝癌细胞的耐药:抑制肝癌LM3细胞中mi R-17-92中高表达成员mi R-92a后,索拉菲尼(Sorafenib)(2.5mol/ml、5mol/ml、10mol/ml、20mol/ml)诱导下的凋亡率升高;7)Mi R-17-92过表达促进肝癌细胞在小鼠体内的成瘤率:利用连续稀释肝癌细胞的NOD-SCID小鼠异种移植实验评价mi R17-92对肝癌细胞体内成瘤率的影响,结果显示接种97L-17-92OE细胞后形成时间早于97L-NTC组,且肿瘤形成率高,ELDA(Extreme limiting dilution analysis)分析得到97L-17-92OE细胞中干细胞频率为1/48160,高于对照97L-NTC细胞中的干细胞数量。总结以上结果,我们得出以下结论,mi R-17-92基因簇通过提高肝癌细胞无血清悬浮培养干细胞球形成率,提高肝癌细胞增殖、迁移能力,提高肝癌细胞化疗药物耐药性,以及皮下移植瘤形成率,表现为促进肝癌细胞干细胞特性。二、Mi RNA-17-92在肝脏损伤中的作用肝脏是维持生命体正常生理活动的重要器官,主要功能是物质代谢,储存糖原,合成分泌性蛋白质,合成胆汁等。与其他组织器官不同的是,肝实质细胞具有迅速核分裂的能力,表现为肝脏旺盛的、活跃的再生能力。临床观察发现,人的肝脏部分切除后6个月后可恢复到切除前大小。这种再生能力不仅表现在肝脏切除后,而且在化学、药物中毒和肝炎病毒感染造成肝细胞损伤时也可发挥作用。但是这种损伤的修复是建立在残存一定数量正常肝细胞的基础之上,如果反复或持续的肝损伤,使肝细胞再生能力下降,则会导致肝纤维化,肝硬化甚至肝癌,例如,黄曲霉毒素之所以能诱发肝硬化,原因就是其能抑制肝细胞的有丝分裂,阻止肝细胞再生。肝脏具有转化体内外各类药物、毒物及代谢产物的作用,但根据其生理特性,肝脏75%的血来自胃肠道、胰、脾等器官的门静脉,也极易造成药物毒物代谢产物等有害物质的堆积,造成肝损伤,而肝损伤后代谢能力减弱,有害物质持续堆积,形成恶性循环。目前已经发现多种mi RNAs参与到肝脏损伤和疾病当中,例如阿司匹林引起的肝脏损伤中mi R-122和mi R-192的表达上调,mi R-449a通过CHI3L1靶向调控NOTCH信号通路参与HCV病毒感染后导致的炎症和纤维化,但是涉及mi R-17-92的报道还不多,仅有mi R-17-92缺失导致p21和Pten蛋白表达升高,抑制肝脏再生。本研究利用Alb-cre-loxp系统得到肝脏组织特异mi R-17-92敲除小鼠方法,通过建立CCl4和Con A肝脏损伤模型,评价mi R-17-92基因簇在肝脏损伤中发挥的作用,为肝脏损伤的防护和治疗提供新的靶点和线索。本研究发现mi R-17-92基因簇对肝脏损伤起保护作用,主要表现在以下几个方面:1)利用mi R-17-92过表达的正常肝脏细胞及对照细胞评价mi R-17-92在CCl4诱导肝细胞损伤中的作用:利用不同浓度(5、10、15、20、25mmol/l)CCl4处理稳定高表达mi R-17-92的肝细胞L02-17-92OE和对照细胞L02-NTC,模拟体外肝细胞损伤,利用MTS检测CCl4处理后肝细胞的存活率。结果显示,L02-17-92OE细胞的存活率高于对照组(P0.05);2)利用肝组织特异的mi R-17-92敲除小鼠及野生小鼠评价了mi R-17-92缺失对急性肝脏损伤的影响:相同周龄雄性mi R17-92肝组织特异性敲除小鼠和野生型小鼠各6只,记为mi R-17-92liver-/-组和WT组,40%CCl4的橄榄油混合液,按照2ml/kg体重的量灌胃,24h后处死,肝脏指数,mi R-17-92liver-/-组5.79±0.23大于WT组3.60±0.44(P0.05),血清ALT指标,mi R-17-92liver-/-组2862±392.39大于WT组1701.5±239.93(P0.05),AST指标mi R-17-92liver-/-组1051.17±791.30大于WT组674.83±120.05(P0.05),组织病理学HE染色结果,mi R-17-92liver-/-组肝细胞坏死广泛而严重,肝细胞索解离,肝细胞溶解,出现弥漫性大片坏死,桥接坏死,肝小叶及汇管区大量炎细胞浸润,WT组汇管区及中央静脉周围大量炎细胞浸润,肝腺泡Ⅰ区肝细胞呈水样变性脂肪变性,可见肝细胞片状坏死,但肝组织结构仍可见,肝组织损伤评分mi R-17-92liver-/-组得分2.8±0.35大于WT组0.9±0.2(P0.05);3)周龄相同雄性mi R17-92肝组织特异性敲除小鼠和野生型小鼠各6只,记为mi R-17-92liver-/-组和WT组,2.5mg/ml Con A溶液,按15mg/kg的量尾静脉注射,24h后处死,肝脏指数,mi R-17-92liver-/-组4.92±0.19大于WT组3.31±0.27(P0.05),血清ALT指标,mi R-17-92liver-/-组11298.17±1727.09大于WT组8399.50±1700.95(P0.05),AST指标mi R-17-92liver-/-组为11641±1528.28大于WT组8886.83±1922.56(P0.05),组织病理学HE染色结果,mi R-17-92liver-/-组肝组织内大量T淋巴细胞浸润,在汇管区尤为明显,肝窦内红细胞弥漫性淤积,且可见大量肝细胞核破裂、凋亡小体、肝细胞脂肪变性等,点、灶状坏死区可见淋巴细胞、中性粒细胞浸润,WT组除肝组织少量淋巴细胞浸润外,无明显异常,肝组织损伤评分mi R-17-92liver-/-组1.9±0.39大于WT组0.2±0.11(P0.05)。总结以上结果,我们得出以下结论,mi R-17-92基因簇可以提升肝癌细胞的自我更新、增殖、迁移能力,也可以提高肝癌细胞皮下移植瘤形成率。同时,我们推测mi R-17-92基因簇通过降低肝细胞对CCl4和Con A的敏感性,在肝脏损伤中起保护作用。
【关键词】：MiRNA17-92 肝癌 干细胞 肝脏损伤
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 英文缩略词表4-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-19
• 1.MiR-17-92 基因簇对肝癌干细胞生物学特性的影响15-16
• 2.MiR-17-92 基因簇在肝脏损伤中的作用16-19
• 第一章 MiR-17-92 对肝癌干细胞生物学特性的影响19-37
• 1.实验材料19-21
• 2.实验方法21-27
• 3.实验结果27-35
• 4.讨论35-37
• 第二章 MiR-17-92 在急性肝脏损伤中的作用37-57
• 1.实验材料37-40
• 2.实验方法40-45
• 3.实验结果45-55
• 4.讨论55-57
• 结论57-58
• 参考文献58-63
• 代表论著63-78
• 致谢78

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本文编号：450087