新型拉曼探针的制备及其在肿瘤标志物检测中的应用

发布时间：2017-06-22 05:03

  本文关键词：新型拉曼探针的制备及其在肿瘤标志物检测中的应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本文结合纳米技术、DNA自组装技术及表面增强拉曼光谱(SERS)技术等,提出了一种新型拉曼探针的制备方法,并将这种新型的拉曼探针应用于肿瘤细胞表面双组分的同时检测,实现了对肿瘤细胞表面活性物质分布情况的成像分析研究,同时将纳米技术结合酶循环放大技术应用于DNA甲基化酶的检测研究,本论文主要从以下三个方面进行了阐述：第一部分提出了基于纳米技术和DNA自组装技术制备新型拉曼探针的方法,通过设计不同碱基序列的三种茎环DNA,通过金-硫键(Au-S)将茎环DNA修饰到金纳米粒子的表面,从而制得纳米金生物条码。在引发链DNA存在的情况下,通过碱基互补配对原则,引发链DNA与茎环DNA结合并将茎环DNA打开,茎环DNA裸露出的一端又可以与另一个茎环DNA分子互补配对打开并裸露出一段DNA链,这样就会引发一系列的茎环DNA的自组装,最终可以得到一个具有枝状结构的纳米球,即为所需的新型的拉曼探针,通过茎环DNA分子的自组装,可以将大量的拉曼信号分子和纳米金结合到一起,从而实现了拉曼信号的放大。第二部分提出了一种基于DNA-纳米金自组装技术和表面增强拉曼光谱(SERS)技术同时检测人类乳腺癌细胞(MCF-7)表面双组分活性物质(MUC 1粘蛋白和核仁素)的一种方法并对其进行成像分析。首先制备了两种拉曼探针,分别标记两种肿瘤标志物,为检测两种活性物质,设计了两种不同的识别探针,具有特异性识别功能的适体不仅能够捕获肿瘤细胞,而且适体链的另一端可以与拉曼探针结合,用Cy3修饰的拉曼探针标记MUC1粘蛋白,Rox修饰的拉曼探针标记核仁素,利用表面增强拉曼光谱技术对两种信号分子进行检测,通过选取两种信号分子的特征峰对两种标志物进行成像分析,可以清晰地看到两种组分在肿瘤细胞表面的分布情况。与单一组分物质的检测相比,双组分肿瘤标志物的同时检测能够为癌症的临床医疗诊断和其在肿瘤发展阶段的机理研究提供更多的帮助。第三部分提出了一种基于纳米金技术、酶循环放大技术和表面增强拉曼光谱(SERS)技术检测DNA甲基化酶的方法,在这种方法中,通过设计茎环DNA分子序列,DNA甲基化酶会在特定碱基识别序列的腺嘌呤上修饰上甲基,具有相同识别位点的限制性内切酶DPnI会将其剪开,并释放出一条新的DNA链,通过已修饰茎环DNA分子的磁性微球捕获这条新的DNA链,并结合由金纳米粒子制备的拉曼探针,在DNA聚合酶和dNTPs的作用下实现了DNA链的循环利用和表面增强拉曼信号的放大,通过这种方法检测甲基化酶的检测限可达5.0×10-6U/μL。
【关键词】：纳米金 DNA自组装 肿瘤标志物 表面增强拉曼光谱(SERS)
【学位授予单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3;O657.37
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-11
• 绪论11-31
• 1.1 拉曼光谱简介11-20
• 1.1.1 拉曼光谱的原理11-12
• 1.1.2 拉曼光谱的特征12-13
• 1.1.3 影响拉曼光谱的主要因素13-14
• 1.1.3.1 影响定量测定的因素13-14
• 1.1.3.2 内标选择14
• 1.1.4 拉曼光谱技术14-16
• 1.1.4.1共振拉曼光谱技术15
• 1.1.4.2 表面增强拉曼散射技术15-16
• 1.1.4.3 傅里叶变换拉曼光谱技术16
• 1.1.5 拉曼光谱仪16-18
• 1.1.5.1 结构概述16-17
• 1.1.5.2 基本部件17-18
• 1.1.5.3 激光共聚焦拉曼光谱仪18
• 1.1.6 拉曼光谱的应用领域18-19
• 1.1.7 拉曼成像技术19-20
• 1.2 拉曼探针20-24
• 1.2.1 金纳米粒子20-23
• 1.2.1.1 金纳米粒子的简介20
• 1.2.1.2 金纳米粒子的性质20-21
• 1.2.1.3 金纳米粒子的应用21-23
• 1.2.2 银纳米粒子23-24
• 1.2.2.1 银纳米粒子的简介23
• 1.2.2.2 银纳米粒子的应用23-24
• 1.3 肿瘤和肿瘤标志物24-25
• 1.3.1 肿瘤24
• 1.3.2 肿瘤标志物24-25
• 1.3.3 肿瘤细胞25
• 1.4 DNA循环放大技术25-30
• 1.4.1 概述25-26
• 1.4.2 聚合酶链式反应(PCR)技术26-27
• 1.4.3 滚环复制放大(RCA)技术27-28
• 1.4.4 杂交链式反应(HCR)技术28-29
• 1.4.5 DNA链取代技术29-30
• 1.5 课题意义及主要研究内容30-31
• 2 基于纳米技术和DNA自组装技术制备新型拉曼探针及探针表征31-45
• 2.1 前言31
• 2.2 实验部分31-36
• 2.2.1 实验试剂与仪器31-33
• 2.2.1.1 试剂31-33
• 2.2.1.2 仪器33
• 2.2.2 实验方法33-36
• 2.2.2.1 金纳米粒子的制备33-34
• 2.2.2.2 单个金纳米探针(H_1-B_1-AuNPs)的制备34
• 2.2.2.3 新型拉曼探针的组装34
• 2.2.2.4 探针拉曼光谱的测定34-35
• 2.2.2.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳35-36
• 2.3 结果与讨论36-44
• 2.3.1 实验原理36
• 2.3.2 扫描电镜表征36-37
• 2.3.3 透射电镜表征37-38
• 2.3.4 探针的紫外光谱表征38-39
• 2.3.5 探针的荧光光谱表征39-40
• 2.3.6 金纳米探针上两种DNA比例的优化40-41
• 2.3.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳表征41
• 2.3.8 反应时间的优化41-42
• 2.3.9 探针的拉曼光谱表征42-44
• 2.3.9.1 探针的拉曼光谱图42-43
• 2.3.9.2 DNA自组装的放大作用43-44
• 2.4 本章小结44-45
• 3 肿瘤细胞表面双组分活性物质的同时检测及成像分析45-59
• 3.1 前言45-46
• 3.2 实验部分46-51
• 3.2.1 试剂与仪器46-48
• 3.2.1.1 试剂46-48
• 3.2.1.2 仪器48
• 3.2.2 实验方法48-51
• 3.2.2.1 金纳米粒子的制备48
• 3.2.2.2 两种拉曼探针的制备48-49
• 3.2.2.3 两种荧光探针的制备49
• 3.2.2.4 乳腺癌细胞的培养49-50
• 3.2.2.5 拉曼探针与肿瘤细胞的结合50
• 3.2.2.6 细胞表面拉曼检测及成像50
• 3.2.2.7 荧光探针与肿瘤细胞的结合50
• 3.2.2.8 细胞表面的荧光成像50-51
• 3.3 实验结果与讨论51-58
• 3.3.1 实验原理51
• 3.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳表征51-52
• 3.3.3 适体的特异性研究52-53
• 3.3.4 DNA自组装放大作用的验证53-54
• 3.3.5 细胞与探针反应温度的优化54-55
• 3.3.6 细胞表面的拉曼成像分析55-56
• 3.3.7 细胞表面的荧光成像分析56-57
• 3.3.8 人类口腔上皮细胞的拉曼成像对比57-58
• 3.4 本章小结58-59
• 4 基于酶循环放大表面增强拉曼光谱检测甲基化酶的研究59-70
• 4.1 前言59
• 4.2 实验部分59-63
• 4.2.1 试剂与仪器59-61
• 4.2.1.1 试剂59-60
• 4.2.1.2 仪器60-61
• 4.2.2 实验方法61-63
• 4.2.2.1 金纳米粒子的制备61
• 4.2.2.2 拉曼探针的制备61-62
• 4.2.2.3 磁性微球的活化62
• 4.2.2.4 DNA在磁性微球表面的固定62
• 4.2.2.5 茎环DNA的甲基化62
• 4.2.2.6 酶循环放大过程62
• 4.2.2.7 拉曼检测62-63
• 4.3 实验结果与讨论63-69
• 4.3.1 实验原理63
• 4.3.2 紫外表征63-64
• 4.3.3 荧光表征64-65
• 4.3.4 实验的可行性研究65
• 4.3.5 实验条件的优化65-68
• 4.3.5.1 拉曼探针中DNA用量的优化65-66
• 4.3.5.2 甲基化时间的优化66-67
• 4.3.5.3 DPnI用量的优化67
• 4.3.5.4 循环放大时间的优化67-68
• 4.3.6 甲基化酶的检测68-69
• 4.4 本章小结69-70
• 结论70-71
• 参考文献71-77
• 致谢77-78
• 攻读学位期间发表及待发表学术论文目录78-79

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