源于内质网的钙信号调节顺铂诱导的人宫颈癌HeLa细胞凋亡

发布时间：2017-06-22 08:01

  本文关键词：源于内质网的钙信号调节顺铂诱导的人宫颈癌HeLa细胞凋亡，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景： 顺铂是临床上传统的抗肿瘤药物，也是妇科肿瘤最常用的化疗药物之一。然而，顺铂在治疗期间的副作用及其治疗抵抗限制了它在临床的应用，因此明确顺铂的细胞杀伤机制尤为重要。传统意义上认为，顺铂是通过损伤DNA和抑制DNA合成起到杀伤癌细胞的作用，这种作用引起了线粒体依赖的凋亡信号以及caspase相关的级联反应，最终导致细胞死亡。在以往的关于疾病和肿瘤的研究认为，化疗药物可以引起细胞内的钙动员，通过靶向线粒体ROS代谢、ATP生成等过程，引发线粒体功能紊乱，导致细胞生长抑制和死亡。与此同时，越来越多的证据显示，顺铂可以通过内质网应激触发相关的凋亡信号，导致细胞死亡。然而，作为与钙离子关系最为密切的内质网，钙信号在化疗药物引起的内质网来源的凋亡通路中的作用尚不清楚。 目的： 明确顺铂对人宫颈癌HeLa细胞内钙离子的影响，探究内质网来源的钙信号在顺铂诱导的人宫颈癌HeLa细胞凋亡的作用，深入探讨顺铂可能的细胞杀伤机制。 方法： 1、用不同浓度的顺铂（2.5μg/mL、5μg/mL和10μg/mL）处理HeLa细胞，分别作用0h、6h、12h和24h后，用荧光钙离子指示剂Fluo-4/AM和Rhod-2/AM孵育细胞，应用激光共聚焦显微镜分别检测细胞质和线粒体内钙离子浓度的变化； 2、顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM（2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞12h和24h小时后，用荧光钙离子指示剂Fluo-4/AM和Rhod-2/AM孵育细胞，应用激光共聚焦显微镜分别检测细胞质和线粒体内钙离子浓度的变化； 3、顺铂单独处理以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞24h后，应用MTT试验检测细胞活性； 4、顺铂单独处理以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞24h后，应用流式细胞术检测细胞凋亡； 5、顺铂单独处理以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞24h，应用荧光染料Hoechst33342着色细胞核，，在激光共聚焦荧光显微镜下观察不同药物处理组细胞核的变化； 6、顺铂单独处理以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞12h后，应用蛋白质免疫印迹实验检测线粒体介导凋亡蛋白与内质网应激相关蛋白在HeLa细胞中的表达； 7、顺铂单独处理以及顺铂（5μg/mL）联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM （2.5μM）或IP3R抑制剂2-APB（100μM）处理HeLa细胞12h后，应用免疫荧光实验检测裂解的caspase-3、GRP78与CHOP在HeLa细胞中的表达。 结果： 1、顺铂同时增加了HeLa细胞细胞质和线粒体内的游离钙离子浓度，且具有时间依赖性和剂量依赖性，联合应用钙离子螯合剂BAPTA/AM或IP3R抑制剂2-APB后，HeLa细胞细胞质与线粒体内的游离钙离子浓度显著降低； 2、顺铂抑制了HeLa细胞细胞活性并诱导了细胞凋亡，联合应用应用钙离子螯合剂BAPTA/AM或IP3R抑制剂2-APB减低了顺铂对HeLa细胞的毒性效应； 3、顺铂上调了钙依赖性钙调水解酶CAPN1与裂解的caspase-3的表达，联合应用应用钙离子螯合剂BAPTA/AM或IP3R抑制剂2-APB降低了顺铂诱导的CAPN1与裂解的caspase-3表达水平； 4、顺铂上调了内质网应激蛋白GRP78、CHOP与裂解的caspase-4的表达，联合应用应用钙离子螯合剂BAPTA/AM或IP3R抑制剂2-APB降低了顺铂诱导的GRP78、CHOP与裂解的caspase-4表达水平； 结论： 顺铂诱导人宫颈癌HeLa细胞发生内质网应激，导致内质网内钙平衡紊乱，大量钙离子外流，外流的钙信号参与调控了顺铂诱导的HeLa细胞线粒体和内质网介导的细胞凋亡。
【关键词】：钙 顺铂 凋亡 内质网应激 宫颈癌
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.33
【目录】：

• 前言4-5
• 中文摘要5-8
• abstract8-14
• 第1章 文献综述14-22
• 1.1 内质网应激（ERS）14-16
• 1.2 UPR 跨膜信号转导16-17
• 1.3 UPR 与凋亡间的信号转导17-19
• 1.3.1 内源性途径18-19
• 1.3.2 外源性途径19
• 1.4 内质网钙调控与细胞死亡机制19-22
• 第2章 材料与方法22-29
• 2.1 实验材料22-24
• 2.1.1 主要仪器22-23
• 2.1.2 主要试剂23-24
• 2.2 实验方法24-28
• 2.2.1 人宫颈癌 Hela 细胞的培养24-25
• 2.2.1.1 细胞复苏24
• 2.2.1.2 细胞传代24
• 2.2.1.3 细胞冻存24-25
• 2.2.2 细胞活性检测（MTT 比色法）25
• 2.2.3 Western blotting 蛋白免疫印迹实验25-26
• 2.2.4 免疫荧光实验26-27
• 2.2.4.1 细胞质和线粒体内游离钙离子水平检测26-27
• 2.2.4.2 观测细胞核（凋亡）27
• 2.2.4.3 细胞内蛋白水平（定性）检测27
• 2.2.5 流式细胞术27-28
• 2.2.6 统计学处理28
• 2.3 实验流程28-29
• 第3章 实验结果29-41
• 3.1 顺铂对 HeLa 细胞内钙离子水平的影响29-31
• 3.1.1 顺铂引起 HeLa 细胞生长抑制29
• 3.1.2 顺铂增加细胞质中游离的钙离子水平29-30
• 3.1.3 顺铂增加线粒体中游离的钙离子水平30-31
• 3.2 钙信号参与调控顺铂诱导的 HeLa 细胞凋亡31-37
• 3.2.1 阻断钙信号后细胞质内钙离子变化31-32
• 3.2.2 阻断钙信号后线粒体内钙离子变化32-33
• 3.2.3 阻断钙信号可以抑制顺铂引起的 HeLa 细胞凋亡33-37
• 3.3 顺铂诱导的促凋亡钙信号来源于内质网应激37-41
• 第4章 讨论41-44
• 第5章 结论44-45
• 参考文献45-58
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果58-59
• 致谢59-60

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