牛β-乳球蛋白在人肠道肿瘤细胞中相互作用蛋白的研究

发布时间：2017-06-23 15:17

  本文关键词：牛β-乳球蛋白在人肠道肿瘤细胞中相互作用蛋白的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：p-乳球蛋白(p-lactoglobulin, β-LG)是乳清蛋白的主要成分,属于Lipocalin家族,能和视黄醇、p-胡萝卜素、维生素D等脂溶性小分子化合物结合,起到载体作用,因此,具有应用于口服结肠定位给药系统的潜力。由于p-LG具有保护脂溶性小分子不受胃肠道环境影响的作用,研究p-LG进入肠道细胞的方式具有重要意义。目前关于p-LG受体的报道还比较少,只有关于人恶性多发性畸胎瘤细胞、红细胞、生殖细胞、哺乳动物杂交瘤细胞中受体的研究,有关p-乳球蛋白在肠道细胞中受体的研究还未见报道。本课题通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation, Co-IP)技术结合一维聚丙烯酰胺凝胶电泳以及纳升级液相色谱-串联质谱(nanoLC-MS/MS)技术研究牛p-LG在肠道肿瘤细胞中的识别受体。选择体外肠道肿瘤研究较为常用的细胞株Caco-2细胞和LoVo细胞进行体外培养,作为本课题的受试细胞。发现Caco-2细胞形态伸展连接成片,传代后72 h时细胞汇合度达到90%以上。LoVo细胞形态规则,48 h时汇合度达到90%。将受试细胞以106个/mL的浓度接种于玻底培养皿。使用荧光探针分别标记细胞膜、细胞核；激光共聚焦显微镜观察荧光标记的p-LG与细胞作用0 min、15 min、30 min、60 min时p-乳球蛋白与细胞的相互作用情况。结果发现在p-LG分别与Caco-2细胞和LoVo细胞相互孵育的0-30 min内,p-LG随时间的延长逐渐在细胞膜外侧聚集,但在30-60 min内β-LG在细胞膜外侧的聚集量没有明显变化。进一步研究p-LG与肠道肿瘤细胞的相互作用,将p-LG与Caco-2细胞和LoVo细胞分别进行1h孵育后,使用Co-IP分离p-LG及其在肠道肿瘤细胞上的相互作用蛋白。将Co-IP分离下来的样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)电泳、考马斯亮蓝染色、免疫印迹法检测。结果发现Co-IP分离出的样品经过SDS-PAGE电泳分离后、考马斯亮蓝染色观察发现,在20-70 kDa之间存在蛋白条带,但无法观察到β-LG的蛋白条带；经免疫印迹法检测,发现Co-IP分离出的样品存在β-LG,说明Co-IP成功分离β-LG及其肠道肿瘤细胞相互作用蛋白。利用硝酸银染色法和nanoLC-MS/MS技术鉴定β-LG在肠道肿瘤细胞Caco-2细胞和LoVo细胞的相互作用蛋白。结果发现两株肠道肿瘤细胞中存在与β-LG相互作用的蛋白可能是组蛋白H4、核糖体蛋白S18、S25,共3种蛋白,但未发现细胞受体。
【关键词】：β-乳球蛋白 免疫共沉淀 口服结肠给药系统 免疫印迹
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.3
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 绪论10-23
• 1.1 大肠癌现状10-11
• 1.2 口服结肠定位给药系统研究进展11-15
• 1.3 β-乳球蛋白的研究进展15-21
• 1.3.1 β-乳球蛋白来源15-16
• 1.3.2 β-乳球蛋白分子结构16-17
• 1.3.3 β-乳球蛋白生物活性及研究进展17-18
• 1.3.4 β-乳球蛋白耐水解特性及研究进展18-19
• 1.3.5 β-乳球蛋白致敏性及研究进展19-21
• 1.4 课题研究意义和内容21-23
• 1.4.1 课题研究意义21-22
• 1.4.2 课题研究内容22-23
• 第二章 激光共聚焦显微镜观察肠道肿瘤细胞和β-LG的相互作用23-40
• 2.1 引言23-24
• 2.2 材料与方法24-28
• 2.2.1 材料与试剂24-25
• 2.2.2 仪器设备25
• 2.2.3 试验方法25-28
• 2.3 结果与讨论28-38
• 2.3.1 肠道肿瘤细胞的体外培养与观察28-30
• 2.3.2 激光共聚焦观察β-LG与LoVo细胞的相互作用30-34
• 2.3.3 激光共聚焦观察β-LG与Caco-2细胞的相互作用34-38
• 2.4 小结38-40
• 第三章 免疫共沉淀鉴定肠道肿瘤细胞与β-LG的相互作用40-52
• 3.1 引言40-41
• 3.2 材料与方法41-46
• 3.2.1 材料与试剂41-42
• 3.2.2 仪器设备42
• 3.2.3 实验方法42-46
• 3.3 结果与讨论46-51
• 3.3.1 BCA法检测蛋白浓度46-47
• 3.3.2 免疫共沉淀样品的Western Blot分析47-51
• 3.4 小结51-52
• 第四章 nanoLC-MS/MS鉴定肠道肿瘤细胞中与β-LG相互作用蛋白52-63
• 4.1 引言52
• 4.2 材料与方法52-55
• 4.2.1 材料与试剂52-53
• 4.2.2 仪器设备53
• 4.2.3 实验方法53-55
• 4.3 结果与讨论55-62
• 4.3.1 β-LG免疫共沉淀复合物SDS-PAGE凝胶的银染分析55-57
• 4.3.2 差异条带的质谱鉴定57-62
• 4.4 小结62-63
• 第五章 结论与展望63-65
• 5.1 结论63-64
• 5.2 展望与不足64-65
• 参考文献65-73
• 附录73-75
• 附录1：质谱检测Co-IP分离样品总离子流图73-75
• 致谢75-76
• 攻读学位期间发表论文情况76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：475483