胰腺癌细胞对基质成纤维细胞的影响及机制研究

发布时间：2017-06-25 13:17

  本文关键词：胰腺癌细胞对基质成纤维细胞的影响及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景近年来研究显示肿瘤的发生和发展与由多种基质细胞、细胞因子、趋化因子等组成的肿瘤微环境密切相关,其中癌相关成纤维细胞(cancer associated fibroblasts,CAFs)越来越受到关注。胰腺癌中基质细胞含量丰富,尤其是CAFs,大量研究认为胰腺癌中的CAFs可促进癌细胞的增殖迁移等生物学功能,但对于癌细胞在CAFs的产生过程中所发挥的作用及其机制的研究相对较少。目的1.观察胰腺癌细胞系与正常成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)共培养、癌细胞中的微囊泡(microvesicles,MVs)刺激NFs两种方式能否诱导NFs活化成CAFs,以及上述刺激对成纤维细胞生物学行为的影响。2.初步探索胰腺癌细胞促进NFs活化成CAFs的发生机制。方法1.原代分离培养野生型C57小鼠胰腺组织中的NFs,将其与胰腺癌细胞系BXPC-3、SW1990进行共培养,运用western方法检测共培养后成纤维细胞中α-SMA、FAP含量,并采用edu方法检测成纤维细胞增殖能力变化。2.采用超速离心法提取上述胰腺癌细胞系中的MVs并分别用其刺激NFs,同样方法检测相应蛋白含量以及成纤维细胞增殖能力。3.采用Trizol试剂盒法提取成纤维细胞中的RNA,后进行逆转录以及qRT-PCR实验检测12种miRNA含量,并采用同样方法提取MVs以及相应量MV-free中上述miRNA含量;4.根据前述结果,在NFs中转染miR-155类似物(即pre-miR-155),同样检测α-SMA、FAP含量以及成纤维细胞增殖能力。5.在胰腺癌细胞株中转染miR-155抑制剂(即anti-miR-155),收集MVs并刺激NFs,然后检测α-SMA、FAP含量以及成纤维细胞增殖能力。6.选取miR-155的下游靶基因TP53inp1,western方法检测共培养前后、MVs刺激前后、在nfs中转染pre-mir-155前后、敲除mir-155的mvs刺激前后的成纤维细胞中tp53inp1蛋白含量变化。7.在nfs中转染tp53inp1基因的干扰rna,同样采用western方法检测干扰前后的成纤维细胞中α-sma、fap含量变化以及其增殖能力变化。结果1.nfs分别与胰腺癌细胞系bxpc-3、sw1990共培养后,其中cafs标志蛋白α-sma含量分别提高了(84.70±0.36)%、(69.11±0.26)%(p0.05),fap蛋白含量分别升高了(59.82±0.49)%,(42.17±0.11)%(p0.05),共培养后cafs增殖能力分别提高了(57.33±0.08)%,(48±0.12)%(p0.05)。2.从bxpc-3、sw1990细胞中提取的mvs刺激nfs,可见刺激之后的成纤维细胞中α-sma含量分别提高了(61.06±0.12)%,(54.47±0.20)%(p0.05),fap蛋白含量分别升高(85.46±0.67)%,(49±0.24)%(p0.05),刺激之后的cafs增殖能力分别提高了(3.47±0.44)倍,(4.65±0.60)倍(p0.05)。3.在所选取的12种mirna中,mir-155在nfs与bxpc-3、sw1990共培养之后的成纤维细胞中分别升高了(1.50±0.45)倍、(1.95±0.65)倍(p0.05),同时mir-155在bxpc-3细胞的mvs以及sw1990细胞的mvs刺激后的成纤维细胞中分别升高了(1.11±0.35)倍,(87.90±0.27)%(p0.05),并且mir-155在bxpc-3细胞的mvs以及sw1990细胞的mvs中富集量分别是相应mv-free的(7.37±0.66)倍,(7.85±0.62)倍(p0.05)。4.在nfs中转染pre-mir-155后,成纤维细胞中α-sma、fap蛋白含量分别升高了(1.52±0.11)倍,(1.71±0.67)倍(p0.05),转染后的成纤维细胞增殖能力提高了(94.11±0.17)%(p0.05)。5.敲除了mir-155的胰腺癌细胞系的mvs刺激nfs后,与阴性对照相比,成纤维细胞中α-sma、fap蛋白含量无明显差别;同样地,成纤维细胞增殖能力在刺激前后无明显变化。6.nfs与bxpc-3,sw1990细胞共培养后,其中tp53inp1蛋白含量分别降低了(49.15±0.09)%,(27.54±0.10)%(p0.05);同时,bxpc-3,sw1990细胞的MVs刺激NFs后,其中TP53inp1蛋白含量分别降低了(78.80±0.12)%,(67.95±0.14)%(P0.05);在NFs中转染pre-miR-155后TP53inp1蛋白含量降低了(35.82±0.02)%(P0.05);但是在敲除了miR-155的胰腺癌细胞MVs刺激NFs后,该蛋白含量较阴性对照无明显变化。7.NFs中转染TP53inp1基因的干扰RNA之后,其中α-SMA、FAP蛋白含量分别升高了(90.28±0.11)%,(94.64±0.29)%(P0.05),且转染后的成纤维细胞增殖能力提高了(92.27±0.30)%(P0.05)。结论1.胰腺癌细胞可以促进癌周围基质中NFs活化成CAFs,且活化后的CAFs增殖能力明显增强。2.在胰腺癌周围基质的NFs活化过程中,癌细胞中的miR-155可能通过其自身分泌的MVs包裹运输到达NFs细胞中,并在NFs中靶向TP53inp1蛋白发挥促进NFs活化作用。
【关键词】：胰腺癌细胞 成纤维细胞 微囊泡 miRNA
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.9
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-16
• 第一部分 胰腺癌细胞对基质成纤维细胞影响的研究前言16-27
• 1.材料与法16-22
• 2.结果22-25
• 3.讨论25-27
• 第二部分 胰腺癌细胞促进基质成纤维细胞活化的机制研究前言27-43
• 1.材料与方法27-31
• 2.结果31-41
• 3.讨论41-43
• 总结43-44
• 结论44-45
• 参考文献45-48
• 个人简历48-49
• 致谢49-50
• 综述50-56
• 参考文献53-56

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本文编号：482288