P53缺失型HL-60白血病细胞内Nucleostemin下调对mTOR通路介导的自噬活性的影响

发布时间：2017-06-26 21:17

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【摘要】：目的:结合本课题组前期关于p53缺失型HL-60白血病细胞内PI3K/AKT/m TOR通路的研究结果,进一步探讨下调Nucleostemin(NS)对p53缺失型HL-60白血病细胞内m TOR通路介导的自噬活性的影响,为研究PI3K/AKT/m TOR通路作为NS非p53依赖性信号通路的关键节点提供依据。方法:(1)制备重组质粒(编码慢病毒颗粒)和两种辅助包装原件的载体质粒,共转染293T细胞,收集富含病毒颗粒的上清液,浓缩后用293T细胞测定其病毒滴度。(2)分别以低MOI值(MOI=40)和高MOI值(MOI=80)的慢病毒转染液感染HL-60细胞确定慢病毒感染HL-60细胞的合适MOI值。(3)根据合适的MOI值,将NS-RNAi-GV248慢病毒载体转染至HL-60细胞,通过荧光倒置显微镜和Western blot确定转染的效率和NS蛋白的下调情况。(4)采用吖啶橙染色观察慢病毒载体转染后空白对照组、阴性对照组和实验组HL-60细胞内亮红色酸性小体(acid vesicular organelle,AVO)数量的变化。(5)以自噬诱导剂雷帕霉素刺激HL-60细胞所提取的蛋白作为自噬阳性对照蛋白,检测慢病毒转染后空白对照组、阴性对照组和实验组内自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的变化。(6)采用透射电镜检测慢病毒转染后空白对照组、阴性对照组和实验组中HL-60细胞内自噬性结构数量的变化。(7)采用Image J图像处理软件对蛋白条带的灰度进行分析和计算。运用SPSS17.0统计分析软件对数据进行处理,数据以均数±标准差(x±s)表示。多组样本间的比较采用单因素方差分析,进一步两两的比较采用Bonferroni法,校正检验水准α,=0.0167。结果:(1)成功包装NS-RNAi-GV248慢病毒载体,其滴度为4×108TU/ml。(2)NS-RNAi-GV248慢病毒载体感染HL-60细胞的最适MOI值为80。在MOI=80的感染条件下,荧光倒置显微镜检测显示慢病毒载体转染效率大于80%,实验组中HL-60细胞NS蛋白出现了明显的下调。(3)吖啶橙染色结果显示,实验组HL-60细胞内AVO数量[(22.4±0.76)%]高于空白对照组[(3.1±0.28)%]和阴性对照组[(6.2±0.64)]%(p0.05);Western blot结果显示实验组中HL-60细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值(1.537±0.072)高于阴性对照组(1.010±0.039)和空白对照组(0.608±0.008)(p0.05);透射电镜检测显示实验组中HL-60细胞内自噬性结构的数量(8.7±3.1)高于阴性对照组(4.2±1.2)和空白对照组(2.3±0.5)(p0.05)。结论:(1)下调NS蛋白的表达可以增强HL-60细胞的自噬活性。(2)NS变化引起的自噬活性的改变,提示m TOR通路可能属于NS的非p53依赖性通路之一,为继续研究NS非p53依赖性通路的细节奠定了基础。
【关键词】：nucleostemin 非p53依赖性通路 慢病毒载体 自噬 PI3K/AKT/mTOR通路
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 中英文缩略词10-11
• 引言11-13
• 1 实验材料13-18
• 2 实验方法18-29
• 3 结果判断29-31
• 4 结果31-40
• 5 讨论40-46
• 6 结论46-47
• 参考文献47-51
• 综述部分51-64
• 参考文献60-64
• 个人简历、硕士研究生期间发表的论文64-65
• 致谢65

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