利用定向蛋白组学液质串联技术对乳腺癌耐药相关膜蛋白的定量分析研究

发布时间：2017-06-28 07:05

  本文关键词：利用定向蛋白组学液质串联技术对乳腺癌耐药相关膜蛋白的定量分析研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:乳腺癌化疗过程中多药耐药性的高发和膜蛋白相关,其中包括P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)和转铁蛋白受体(Transferrin receptor,Tf R)。有研究表明P-gp蛋白能够将化疗药物从乳腺癌肿瘤细胞内泵出到细胞外,它的过度表达与肿瘤多药耐药相关。Tf R蛋白参与铁的吸收并在细胞生长和细胞增殖方面发挥作用,已有很多文献报导Tf R蛋白在许多种癌症包括乳腺癌中过度表达并且耐药细胞和产生耐药的乳腺癌组织中表达量更多。准确定量测定乳腺癌中P-gp蛋白和Tf R蛋白的含量将有助于改善肿瘤的早期检测诊断和预测乳腺癌患者的化疗效果及预后评估。方法:利用基于LC-MS/MS的定向蛋白组学液质串联技术建立对P-gp蛋白和Tf R蛋白定量检测的方法,用于测定乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中P-gp蛋白和Tf R蛋白的含量。结果:1.434STTVQLMQR442,674GSQAQDR680和368IIDNKPSIDSYSK380这三个肽段是P-gp蛋白胰蛋白酶水解的特异性肽段,选取434STTVQLMQR442代替P-gp蛋白作为研究目标物进行定量,建立P-gp蛋白定量检测MRM条件,采用内标法用稳定同位素标记的肽段STTV*QLMQR为内标物并准确测定了乳腺癌细胞系MCF-7/WT和乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR中P-gp蛋白的含量。实验结果与传统的免疫学方法的结果进行对比,包括激光共聚焦技术、蛋白免疫印迹和流式细胞术。最后,利用建立的定量方法对60对产生化疗药物耐受的乳腺癌病人的癌组织和癌旁组织中的P-gp蛋白含量进行了定量检测。2.选取681VEYHFLSPYVSPK693代替Tf R蛋白本身作为研究目标物进行定量,建立Tf R蛋白定量检测MRM条件,采用内标法用稳定同位素标记的肽段V*EYHFLSPYVSPK为内标物。质量控制数据结果显示可接受的准确度和精密度范围,最后利用建立的方法准确测定了三个乳腺癌细胞系和36对乳腺癌病人的癌组织和癌旁组织中Tf R蛋白的含量。实验结果与激光共聚焦技术、蛋白免疫印迹、流式细胞术和组织免疫化学方法所得结果进行比较。结论:基于定向蛋白组学的液质串联质谱技术能准确定量细胞和临床组织样本中的P-gp蛋白和Tf R蛋白,并能应用于低浓度的临床样本的测定。这种方法为将来大规模测定大分子生物标志物提供了一种可能。总而言之,液质串联质谱分析手段具有快速经济、定量限低、灵敏度高、选择性强等优点,尤其是在测定低浓度以及生物样本时更能得到较为可靠的数据。实践证明,液质串联质谱技术能够作为一种有效的定量分析手段应用于临床样本的检测。
【关键词】：乳腺癌 P-糖蛋白 转铁蛋白受体 液质串联质谱法 定向蛋白组学
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 前言11-14
• 1 实验材料14-17
• 1.1 细胞株14
• 1.2 乳腺癌组织14
• 1.3 主要试剂14-16
• 1.4 主要仪器16-17
• 2 实验方法17-28
• 2.1 样品溶液配制17-18
• 2.1.1 P-gp贮备液、标准曲线和质控样品的配制17
• 2.1.2 TfR贮备液、标准曲线和质控样品的配制17-18
• 2.2 细胞培养和组织收集18-19
• 2.2.1 细胞培养18
• 2.2.2 组织收集18-19
• 2.3 膜蛋白提取19-20
• 2.3.1 细胞膜蛋白提取19
• 2.3.2 组织膜蛋白提取19-20
• 2.4 基质溶液的制备20
• 2.5 溶液内胰蛋白酶水解反应及SPE富集纯化20-21
• 2.6 SDS-PAGE和胶内胰蛋白酶水解反应及SPE富集纯化21
• 2.7 质谱条件21-22
• 2.7.1 液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)21
• 2.7.2 飞行时间质谱(MALDI-TOF)21-22
• 2.8 稳定同位素标记的肽段内标物22
• 2.8.1 稳定同位素标记的P-gp肽段内标物22
• 2.8.2 稳定同位素标记的TfR肽段内标物22
• 2.9 方法学验证22-23
• 2.10 常规的免疫学方法23-28
• 2.10.1 蛋白免疫印迹(western blotting)23-24
• 2.10.2 免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)24-27
• 2.10.3 激光共聚焦(confocal microscopy)27
• 2.10.4 流式细胞术(flow cytometry)27-28
• 3 结果与讨论28-55
• 3.1 利用基于LC-MS/MS的定向蛋白质组学对P-gp的研究28-43
• 3.1.1 细胞和组织的P-gp的提取28-29
• 3.1.2 P-gp胰蛋白酶水解特异性肽段在LC-MS/MS上的响应29-31
• 3.1.3 胰蛋白酶水解效率的考察31-32
• 3.1.4 P-gp的LC-MS/MS方法的建立及验证32-36
• 3.1.5 乳腺癌细胞中P-gp含量测定36-39
• 3.1.6 乳腺癌组织中P-gp含量测定39-43
• 3.2 利用基于LC-MS/MS的定向蛋白质组学对TfR的研究43-55
• 3.2.1 细胞和组织的TfR的提取43-44
• 3.2.2 TfR胰蛋白酶水解特异性肽段在LC-MS/MS上的响应44-46
• 3.2.3 胰蛋白酶水解效率的考察46-47
• 3.2.4 TfR的LC-MS/MS方法的建立及验证47-50
• 3.2.5 乳腺癌细胞中TfR含量测定50-51
• 3.2.6 乳腺癌组织中TfR含量测定51-55
• 4 结论55-56
• 参考文献56-63
• 综述63-71
• 参考文献68-71
• 硕士研究生期间发表文章情况71-72
• 致谢72-73

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7 ;新技术清晰拍摄早期乳腺癌细胞[J];上海生物医学工程;2005年04期

8 田富国;郭向阳;张华一;;乳腺癌诊治研究新进展[J];肿瘤研究与临床;2005年S1期

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1 于永利;;抗乳腺癌免疫治疗融合蛋白[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年

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5 刘爱国;胡冰;;乳腺癌临床治疗进展[A];安徽省抗癌协会第四次代表大会暨乳腺癌、肺癌专业委员会成立会议、安徽省肿瘤防治进展学术研讨会论文汇编[C];2001年

6 张嘉庆;王殊;乔新民;;乳腺癌的现状和远景[A];第一届全国中西医结合乳腺疾病学术会议论文汇编[C];2002年

7 刘清俊;;乳腺癌综合治疗的新进展[A];山西省抗癌协会第六届肿瘤学术交流会论文汇编[C];2003年

8 邵志敏;;21世纪乳腺癌治疗的展望[A];第三届中国肿瘤学术大会教育论文集[C];2004年

9 陈松旺;张明;;乳腺癌治疗的回顾与展望[A];西部地区肿瘤学学术会议论文汇编[C];2004年

10 白霞;傅建新;丁凯阳;王兆钺;阮长耿;;组织因子途径抑制物-2在乳腺癌细胞中的表达研究[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

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1 ;血检有望揭示乳腺癌治疗效果[N];医药经济报;2004年

2 记者 郑晓春;乳腺癌细胞扩散基因被找到[N];科技日报;2007年

3 中国军事医学科学院肿瘤中心主任 宋三泰;乳腺癌有了新疗法[N];中国妇女报;2002年

4 王艳红;抑制ＤＮＡ修补可消灭乳腺癌细胞[N];医药经济报;2005年

5 詹建;乳腺癌饮食 两个时期不一样[N];中国中医药报;2006年

6 辛君;乳腺癌扩散基因“浮出水面”[N];大众卫生报;2009年

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本文编号：492908