靶向癌胚抗原的嵌合受体的构建及初步应用

发布时间：2017-06-29 18:11

  本文关键词：靶向癌胚抗原的嵌合受体的构建及初步应用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的过继细胞治疗(adoptive cell therapy,ACT)是指自体免疫细胞进行体外大量扩增,然后将其回输至肿瘤患者体内。因其副作用小,安全性高,可去除肿瘤患者体内微小残留灶等优点。目前临床上广泛使用的是非特异性的过继细胞治疗,如淋巴因子活化的杀伤细胞(lymphokine activated killer cell,LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK)等。由于这些细胞并非经过肿瘤特异性筛选,其TCR识别肿瘤抗原具有随机性,且肿瘤细胞通常下调MHC分子,从而抑制T细胞对肿瘤抗原识别和杀伤。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors,CARs)由抗原识别域、铰链区、跨膜区和胞内信号域依次连接组成,抗原识别域即sc Fv(single chain variable fragment),由肿瘤特异性单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)结构域连接构成;胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ,或与一种或多种共刺激分子相连,如OX-40/CD134,CD137/4-1BB,CD28等。肿瘤细胞表面的抗原(配体)与嵌合抗原受体的抗体(受体)结合时,通过铰链区和跨膜区将信号传递至胞内,胞内信号域将信号转化为活化信号,激活效应细胞,效应细胞增殖、产生多种细胞因子如TNF-α、IFN-γ、穿孔素、颗粒酶等从而杀伤肿瘤细胞。其具有以下优势:特异性:○1抗体(受体)特异性识别抗原(配体);○2 MHC非限制性:不需要与MHC-Ⅰ分子结合,并且可克服肿瘤细胞不表达或低表达肿瘤抗原及肿瘤微环境下调MHC-Ⅰ分子造成的免疫逃逸;○3不会出现转基因TCR与患者内源性TCR发生错配的情况;○4抗原来源广,可以是糖类、脂类、蛋白质。癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)是一种糖蛋白,在60-94%转移、复发结直肠癌中高表达,广泛应用于结直肠癌临床辅助诊断、预后及复发监测指标。因此在已有研究基础上本研究利用分子克隆技术构建了以抗CEA单链抗体为嵌合抗原受体的慢病毒载体LV-EF1α-sc Fv(CEA)-CD3-2A-GFP-WPRE,其胞内信号为CD3ζ链。通过慢病毒包装,感染人T细胞,探讨该嵌合抗原受体在T细胞中的表达情况及对结直肠癌CEA阳性肿瘤细胞系的杀伤作用。为后续研究及应用嵌合抗原受体修饰T细胞治疗结直肠癌奠定基础。方法1.分子克隆技术构建慢病毒载体LV-EF1α-scFv(CEA)-2A-GFP-WPRE。2.磷酸钙法包装慢病毒。3.慢病毒感染人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)细胞。4.流式细胞术和非变性非还原Western blot检测sc Fv(CEA)-CAR在T淋巴细胞中的表达。5.体外实验检测CAR修饰T细胞对结直肠癌CEA阳性肿瘤细胞系,CEA阴性肿瘤细胞杀伤作用。结果1.经PCR扩增、酶切、连接等常规分子克隆技术及核苷酸序列检测,证实成功构建慢病毒载体LV-EF1α-sc Fv(CEA)-2A-GFP-WPRE。2.磷酸钙法包装慢病毒,经流式细胞术测得病毒滴度为3×107TU/ml。3.以10MOI慢病毒感染外周血单个核细胞,经过14天的培养,荧光显微镜下观察到感染后T细胞呈典型聚集生长型态,且细胞表达GFP荧光,表明慢病毒成功感染T细胞。4.流式细胞术检测scFv(CEA)-CAR在感染后T细胞的表达率为62.8%,非变性非还原Western blot证实感染后的T细胞可正确表达抗CEA抗体。5.CAR修饰T细胞对结直肠癌CEA阳性肿瘤细胞系有特异性的杀伤作用,CEA阴性的肿瘤细胞系几乎无杀伤作用。结论嵌合抗原受体可在T细胞中正确表达,对结直肠癌CEA阳性肿瘤细胞系有特异性杀伤作用。为后续体内研究及应用嵌合抗原受体修饰T细胞治疗结直肠癌打下坚实的基础。
【关键词】：结直肠癌 嵌合抗原受体 癌胚抗原 T淋巴细胞 慢病毒 免疫治疗
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 构建慢病毒载体LV-EF1α-sc Fv（CEA）-2A-GFP-WPRE13-25
• 2.1 材料13-17
• 2.2 方法17-22
• 2.3 结果22-24
• 2.4 讨论24-25
• 第三章 靶向癌胚抗原的嵌合受体的初步应用25-40
• 3.1 材料25-29
• 3.2 方法29-35
• 3.3 结果35-38
• 3.4 讨论38-40
• 全文结论40-41
• 参考文献41-48
• 文献综述 嵌合抗原受体修饰免疫细胞治疗技术研究进展48-61
• 参考文献54-61
• 攻读学位期间的研究成果61-62
• 致谢62

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本文编号：498820