miR-497通过靶向Smad7基因对乳腺癌的作用研究

发布时间：2017-06-30 18:22

  本文关键词：miR-497通过靶向Smad7基因对乳腺癌的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的乳腺癌是严重危害女性健康的主要恶性肿瘤之一,同时也是世界女性发病率最高的癌症。全世界每年约有120万女性患乳腺癌,50万死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家,乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。而我国是乳腺癌发病率增长最快的国家之一,我国近年来乳癌发病率正以每年3%的速度递增,成为城市中死亡率增长最快的癌症,发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势。在上海等大中城市中,乳腺癌患病率已连续20年位居女性恶性肿瘤第一位,严重危害广大女性的健康。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类进化上保守的非编码小分子RNA,具有在翻译水平调控基因表达的功能。这些miRNAs可以调节细胞生长,组织分化,因而与生命过程中发育、疾病有关。最近的研究发现,miRNA的表达与多种肿瘤相关,在肿瘤发生过程中起至关重要的作用,这些miRNAs的作用类似于抑癌基因和癌基因。不同肿瘤中mi RNA有不同的表达谱。一种miRNA可以靶向多种靶基因从而发挥作用,而一个靶基因可以同时被多种miRNA靶向。最新研究表明,Smad 7在乳腺肿瘤发生发展中发挥着重要作用。本研究中,我们通过targetscan,miRanda等软件分析发现Smad 7可能为mi R-497的靶基因,运用双荧光素酶实验、RT-PCR和Western Blot研究方法证实miR-497通过靶向Smad 7来发挥作用,同时在MDA-MB-231和MCF-7细胞系中验证高表达miR-497对细胞功能的影响,为乳腺癌的个体化治疗提供新的靶点。方法我们根据websites targetscan,miRanda,miRGen and miRBase等软件发现,Smad 7为miR-497可能的靶基因。为了验证miR-497是否可以靶向Smad 7的3'-UTR区从而发挥生物学作用,我们设计了双荧光素酶实验,同时运用RT-PCR和Western Blot实验来证实双荧光素酶实验的结果。MTT实验,平板克隆实验和细胞周期实验来研究miR-497在MDA-MB-231乳腺癌细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系中的作用。结果1、本研究中,运用websites targetscan,miRanda,miRGen and miRBase等软件发现,miR-497的碱基序列与Smad 7 mRNA 3'-UTR区存在互补关系,Smad 7为miR-497的靶点之一。2、通过双荧光素酶实验发现,在MDA-MB-231乳腺癌细胞系中,实验组(共转染miR-497 mimics与Smad 7 3'-UTR)与对照组(共转染miR-497 control与Smad 73'-UTR)相比,荧光值明显下降(P0.05)。共转染mi R-497 mimics与Smad 7 3'-UTR-mut后,荧光值上升(P0.05)。在MCF-7乳腺癌细胞系中,实验组(共转染miR-497 mimics与Smad 7 3'-UTR)与对照组(共转染mi R-497control与Smad 73'-UTR)相比,荧光值明显下降(P0.05)。共转染miR-497mimics与Smad 7 3'-UTR-mut后,荧光值上升(P0.05)。3、在MDA-MB-231乳腺癌细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系中,分别过表达miR-497后,运用RT-PCR技术和Western Blot实验分别检测Smad 7 mRNA表达量与Smad 7蛋白的表达量,发现在miR-497过表达组Smad 7 m RNA与Smad7蛋白的表达量均下降,差异有统计学意义(P0.05)。4、在MDA-MB-231乳腺癌细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系中,分别按照0、25、50、75、100nmol/l浓度转染miR-497,培养24h、48h、72h后,加入MTT在490nm下测得相应OD值绘制曲线后分析,随着时间和浓度的增加,抑制率随之增加,表现出时间和浓度的依赖性,表明,miR-497有抑制细胞增殖的作用。5、在MDA-MB-231乳腺癌细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系中,分别转染miR-497 mimics(100nM)与miR-497 control,培养48h后,平板克隆实验结果证明,与miR-497 control组相比,miR-497 mimics组克隆形成率明显下降,表明,miR-497有抑制细胞增殖的作用。6、在MDA-MB-231乳腺癌细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系中,分别转染miR-497 mimics(100nM)与miR-497 control,培养48h后,流式细胞仪检测细胞周期。与miR-497 control组相比,miR-497 mimics组G1期细胞比例增多(P0.05)。结论本研究显示,miR-497在乳腺癌中可以作为一种肿瘤抑制基因。其通过靶向Smad 7来发挥相应的生物学作用。在MDA-MB-231乳腺癌细胞系和MCF-7乳腺癌细胞系中过表达miR-497可以抑制细胞增殖,抑制细胞周期。miR-497可以作为乳腺癌治疗的新靶点。
【关键词】：乳腺肿瘤 miRNA 靶基因 Smad7 细胞增殖
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 对象和方法14-34
• 1.1 实验材料14-16
• 1.1.1 细胞14
• 1.1.2 主要试剂14-16
• 1.1.3 主要仪器16
• 1.2 实验方法16-33
• 1.2.1 引物设计16-17
• 1.2.2 序列合成17
• 1.2.3 细胞复苏、细胞培养和细胞冻存17-19
• 1.2.4 脂质体转染19-20
• 1.2.5 双荧光素酶实验20-21
• 1.2.6 miRNA RT-PCR21-25
• 1.2.7 mRNA RT-PCR25-27
• 1.2.8 Western blot27-32
• 1.2.9 MTT实验32
• 1.2.10 平板克隆实验32
• 1.2.11 流式细胞仪检测细胞周期32-33
• 1.3 统计方法33-34
• 结果34-43
• 2.1 生物信息分析、双荧光素酶实验及转染确定Smaad 7 为miR-497靶点34-39
• 2.1.1 生物信息分析确定Smad 7 为miR-497的靶点34
• 2.1.2 MDA-MB -231乳腺癌细胞系和MCF- 7 乳腺癌细胞系中双荧光素酶实验验证Smad 7 为miR-497的靶点34-35
• 2.1.3 MDA-MB -231乳腺癌细胞系和MCF- 7 乳腺癌细胞系中转染实验进一步验证Smad 7 为miR-497的靶点35-39
• 2.2 miR-497对MDA-MB -231乳腺癌细胞系和MCF- 7 乳腺癌细胞系增殖的影响39-41
• 2.2.1 MTT法检测miR-497对MDA-MB -231乳腺癌细胞系和MCF- 7 乳腺癌细胞系增殖活性的影响39-40
• 2.2.2 平板克隆实验检测miR-497对MDA-MB -231乳腺癌细胞系和MCF- 7 乳腺癌细胞系克隆形成能力的影响40-41
• 2.3 流式细胞仪检测miR-497对MDA-MB -231乳腺癌细胞系和MCF- 7 乳腺癌细胞系细胞周期的影响41-43
• 讨论43-47
• 3.1 miR-497通过靶向Smad 7 发挥生物学作用43-45
• 3.2 miR-497对MDA-MB -231乳腺癌细胞系和MCF- 7 乳腺癌细胞系增殖的影响45-46
• 3.3 miR-497对MDA-MB -231乳腺癌细胞系和MCF- 7 乳腺癌细胞系细胞周期的影响46-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 发表论文和参加科研情况说明52-53
• 综述 microRNA与肿瘤研究进展53-67
• 综述参考文献62-67
• 致谢67

【共引文献】

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