ALA介导的光动力疗法诱导皮肤癌A375细胞与A431细胞凋亡机制的研究

发布时间：2017-07-01 09:10

  本文关键词：ALA介导的光动力疗法诱导皮肤癌A375细胞与A431细胞凋亡机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:研究5-α氨基酮戊酸(ALA)介导的光动力疗法(ALA-PDT)对皮肤癌A375细胞与A431细胞的杀伤作用及其诱导其凋亡机制,为ALA-PDT应用于临床提供治疗参数和理论依据。方法:以皮肤黑色素瘤A375细胞与鳞状细胞癌A431细胞为研究对象,1.研究ALA-PDT对皮肤癌细胞的杀伤作用,A375细胞与A431细胞与不同的ALA浓度孵育,在PDT作用后不同的时间,用噻唑蓝法(MTT)法检测其增殖抑制率。2.研究ALA-PDT诱导A375细胞与A431细胞发生凋亡机制。首先用TUNEL染色法分析ALA-PDT作用后A375细胞与A431细胞的凋亡率;接着,用Western-blot方法检测ALA-PDT后两株细胞凋亡过程中,外源性凋亡途径相关蛋白Caspase8,线粒体凋亡途径相关蛋白Bcl-2,Bax与Caspase9以及Caspase3与PARP的表达情况;最后,用免疫组化法检测A375细胞与A431细胞在ALA-PDT作用前后细胞色素c(Cyt-c)在细胞内的分布情况,旨在从内源性与外源性途径揭示ALA-PDT诱发皮肤癌细胞凋亡机制。结果:1.MTT比色法结果显示不同浓度的ALA-PDT组对A375细胞与A431细胞均有杀伤作用,并与ALA药物浓度和ALA-PDT作用后的时间密切相关,在0.4mmol/L ALA-PDT作用后4h,对A375细胞的增殖抑制作用达到最大程度;在0.6mmol/L ALA-PDT作用后8h,对A431细胞的增殖抑制作用达到最大程度,趋于平衡。2.TUNEL染色结果显示ALA-PDT作用后阳性反应在细胞核染色质浓缩区出现棕黄色沉淀反应,即细胞发生凋亡,且呈时间依赖性增加。A375细胞在ALA-PDT作用后0.5h,1h,2h,4h与6h的凋亡率分别是11.79%,44.84%,63.75%,75.33%与90%。A431细胞在ALA-PDT作用后1h,2h,4h,6h与8h的凋亡率分别是10%,25%,55.5%,61.54%与70%。3.Western blot的检测结果显示ALA-PDT作用激活了A375细胞与A431细胞的外源性凋亡途径和线粒体凋亡途径,启动了Bcl-2家族及Caspase家族参与凋亡过程。随着ALA-PDT作用后孵育时间的延长,抗凋亡蛋白Bcl-2下调,促凋亡蛋白Bax上调;出现Caspase蛋白的级联反应及剪切。A375细胞在ALA-PDT作用后0.5h,1h与2h出现Caspase3,8与9剪切体且上调;但是在ALA-PDT作用后4h与6h上述剪切体下调。A431细胞在ALA-PDT作用后1h,2h与4h出现上述剪切体且上调;但是ALA-PDT作用后6h与8h上述剪切体下调;而且,ALA-PDT作用后,A375细胞与A431细胞出现PARP前体的下调和剪切体的上调,最终导致细胞凋亡。4.Cyt-c免疫组化结果显示ALA-PDT作用前,阳性反应在皮肤癌A375细胞与A431细胞胞质核周出现棕黑色沉淀;ALA-PDT作用后,棕黑色沉淀向远离核周的胞质区均匀铺展,即细胞色素C在ALA-PDT作用后,由富含线粒体的核周区释放至胞质,参与细胞的凋亡过程。结论:ALA-PDT能明显抑制A375细胞与A431细胞的增殖,并诱导其发生凋亡。凋亡的发生与启动细胞外源性凋亡途径和细胞色素C相关的线粒体凋亡途径相关。
【关键词】：5-α氨基酮戊酸 光动力疗法 皮肤癌 凋亡
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5;R730.43
【目录】：

• 英文缩略词4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-11
• 材料与方法11-19
• 1 实验材料11-14
• 1.1 细胞系11
• 1.2 主要试剂11-12
• 1.3 主要仪器12
• 1.4 主要溶液的配制12-14
• 2 实验方法14-19
• 2.1 细胞培养14
• 2.2 MTT比色法检测ALA-PDT对A375 细胞与A431 细胞的杀伤作用14-15
• 2.3 TUNEL染色法检测细胞凋亡率15-16
• 2.4 Western blot方法检测凋亡相关蛋白16-18
• 2.5 免疫组化-SABC法检测Cyt-c的细胞定位18-19
• 3 统计学分析19
• 结果19-26
• 1 ALA-PDT可显著杀伤A375 细胞与A431 细胞19-22
• 2 TUNEL染色法的检测结果22-23
• 3 Western-blot检测结果23-25
• 4 免疫组化-SABC法检测Cyt-c蛋白的表达25-26
• 讨论26-30
• 参考文献30-34
• 综述34-41
• 参考文献37-41
• 致谢41

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本文编号：505314