BRAF突变肽核酸钳制-PCR检测法的建立

发布时间：2017-07-02 13:25

  本文关键词：BRAF突变肽核酸钳制-PCR检测法的建立，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景结直肠癌的发病率逐年增加,并且先进的生物靶向治疗主要针对复发患者。大肠癌术后治疗计划,美国FDA和我国明确指出,在一线和二线化疗计划的实施,加入靶向EGFR受体抗体靶向药物(西妥昔单抗和帕尼单抗)时,需进行药敏基因突变检测。国际大样本多中心研究表明,同时进行KRAS、BRAF突变检测,并按此顺序串联诊断,可最大限度地准确预测患者对于抗体靶向药物的敏感性。现有检测方法主要有:经典测序法、Taqman-ARMS、q PCR-HRM和Scorpion-ARMS。虽然DNA测序为国际公认的分子检测金标准,但其灵敏度较低(10%),有碍其临床广泛应用。国外专利技术蝎形探针ARMS和对应的Taq Man探针法,灵敏度高(0.1%),主要用于各种类型的组织,包括操作,穿刺或内窥镜检查组织,2小时即可完成检测,试剂盒商业化程度高,临床认可程度高,国内已有试剂盒获批CFDA。q PCR-HRM其灵敏度尚可(1%),需要较高档次的Q-PCR仪,多用于研究中,限制了其临床应用。肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一种在结构上与DNA有些许近似,但是在碱基组成上又有一点不同的核酸,其骨架由2-氨乙基甘氨酸代替DNA的磷酸二酯糖后形成了一种远比DNA稳定的核酸。PNA十分稳定,正确配对的DNA/PNA的稳定性远远高于相应的DNA/DNA,同时在PCR反应过程中PNA不可作为Taq酶的底物,亦不会被其他酶所降解。对于错配的PNA/DNA,哪怕只有一个碱基的错配,也会造成其融解温度下降9-10℃左右。目前,肽核酸作为一种非常有用分子生物学工具已在疾病的诊断、治疗等领域得到应用。本课题拟在实验室前期摸索出的肽核酸(PNA)压制-PCR/KRAS突变检测法的基础上,将核心的PNA钳制技术转化应用于结直肠肿瘤组织中BRAF突变的检测,有效抑制样本在PCR反应中BRAF野生型基因的扩增,从而提高突变基因的检测灵敏度以及降低检测下限。研究目的探索肽核酸(PNA)抑制-PCR/BRAF突变检测法的诊断界值及其检测下限。研究方法将含BRAF突变的质粒/细胞株DNA和BRAF野生型组织DNA以不同比例(突变/总体:50%,25%,12.5%,6.25%,3.1%,1.6%,0.8%,0.4%,0)混合配制成参考品,独立配制10个批次并分别进行PNA-PCR/BRAF突变检测,整理出BRAF突变CT值及其总体CT值,并计算ΔCT值(突变CT值-总体CT值),运用ROC曲线拟合的ΔCT作为判明BRAF基因突变的最佳诊断界值(Cut-off值),并根据前者得出对应的检测下限。研究结果阳性参考品在不同突变百分率下的突变CT值、ΔCT值与阴性参考品相比有统计学差异(P0.05),总体CT值与阴性参考品相比无差异。COLO205细胞株ROC曲线的曲线下面积(AUC)是0.9,Cut-off值是11.8,敏感度和特异度分别为78.6%和100%,检测下限为3.1%;M1质粒ROC曲线的AUC是0.974,Cut-off值是12,敏感度和特异度分别达到92.9%和100%,检测下限为1.6%;M2质粒ROC曲线的AUC是0.921,Cut-off值是12,敏感度和特异度各自为87.1%与100%,检测下限为1.6%。结论本研究初步建立了含有肽核酸(PNA)的PCR/BRAF基因突变检测法的截断值和最低检测限,为进一步的临床应用提供了重要的参数。
【关键词】：BRAF基因 突变 肽核酸酸类 聚合酶链式反应
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34;R730.43
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 中英文缩略语表9-10
• 前言10-13
• 第一部分 实验中涉及的质粒与细胞株/组织DNA关于BRAF突变位点的测序13-19
• 一、材料与方法13-16
• 二、实验结果16-18
• 三、讨论18-19
• 第二部分BRAF突变肽核酸(PNA)钳制—PCR检测法的建立19-30
• 一、材料与方法19-23
• 二、实验结果23-29
• 三、讨论29-30
• 全文总结30-31
• 综述 131-37
• 综述 237-43
• 全文参考文献43-56
• 在读期间发表论文和参加科研工作情况56-57
• 在读期间发表论文56
• 参加科研工作情况56-57
• 致谢57

【参考文献】

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1 傅新晖;邓艳红;范新娟;骆衍新;陈典克;王磊;兰平;刘焕亮;汪建平;;利用高分辨率熔解曲线分析法检测结直肠癌中KRAS基因突变[J];中华普通外科学文献(电子版);2009年05期

  本文关键词：BRAF突变肽核酸钳制-PCR检测法的建立，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：510123