两条VEGFR靶向分子探针的修饰及作用靶点的初步研究

发布时间：2017-07-04 06:25

  本文关键词：两条VEGFR靶向分子探针的修饰及作用靶点的初步研究

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【摘要】：研究背景及目的肿瘤的分子显像和靶向治疗是以肿瘤相关分子为靶点,将分子探针或靶向药物特异地定位于肿瘤实质细胞或肿瘤间质,从而达到肿瘤显像或治疗的目的。由于其具有定向、定位、特异性强的优势,逐渐成为核医学及肿瘤学研究领域的热点,为肿瘤的诊治带来了新的希望。其中肿瘤特异靶点的选择及分子探针的筛选是分子显像及靶向治疗能否成功的关键。VEGF/VEGFR具有高的瘤/非瘤比值,与肿瘤血管生成及肿瘤的生长、转移密切相关,为肿瘤诊治研究的重要靶点,以其为靶点设计的分子探针既可用于肿瘤显像,也可作为靶向药物用于肿瘤的治疗。本课题组前期以VEGFR为靶点,通过生物信息学法筛选到2条多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS,体内外实验均证实它们为肿瘤靶向抑制肽,可作为侯选的分子探针或靶向药物用于肿瘤的核素分子显像及靶向治疗。但这2条分子探针在血清中可能易被降解、其作用位点也尚不清楚,如何增强其在血清中的稳定性并进一步探讨其作用位点,对完善其肿瘤靶向机制、抑制肿瘤细胞生长的分子机制具有重要意义。故本研究旨在对这2条肿瘤分子探针进行保护性化学修饰,以提高其在血清中的稳定性,并进一步探讨其作用位点,为其作为分子探针及靶向药物用于肿瘤的分子显像及靶向治疗奠定实验基础。方法1.多肽保护性化学修饰前后的稳定性研究:人工合成多肽,并对其进行N端乙酰化(Ac)、C端酰胺化(NH2)修饰;3H-Td R掺入实验、CCK-8细胞实验比较多肽修饰前后对A549细胞增殖的抑制能力,transwell实验比较多肽修饰前后对A549细胞迁移的抑制能力,间接评价其稳定性;高压液相色谱法(HPLC)测定血清环境下不同时间点多肽剩余量,直接评价其稳定性。2.构建原核表达载体p GEX4T-1-多肽,转化至大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞,诱导表达GST-多肽融合蛋白;谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(Glutathione Sepharose 4B)对融合蛋白进行纯化;蛋白电泳鉴定其表达及纯化效果;免疫共沉淀方法鉴定GST-多肽与VEGFR亚型(VEGFR-1或VEGFR-2)的结合。3.多肽处理A549细胞,Western Blot实验检测多肽对细胞中VEGFR-1和VEGFR-2磷酸化水平的影响。4.RNAi技术沉默VEGF表达,即转染si RNA至A549细胞,Western Blot方法鉴定VEGF蛋白表达水平;CCK-8细胞实验探讨细胞培养体系中无内、外源性VEGF时,多肽对A549细胞增殖的抑制能力。5.生物信息学手段,即分子对接法及动力学模拟技术理论上预测多肽的潜在作用靶点;体外受体竞争结合及免疫共沉淀实验对多肽理论上的作用靶点进一步鉴定。结果1.多肽RKRKRKKSRYIVLS经化学修饰后在10%血清环境下对A549细胞增殖的抑制率由(2.63±6.19)%提高至(48.50±7.14)%(P0.01);细胞活力的抑制率由(1.30±7.90)%提高至(20.80±5.90)%(P0.01);对A549细胞迁移的抑制率由(7.02±8.64)%提高至(38.86±7.69)%(P0.01)。HPLC结果显示:经化学修饰,12h后多肽RKRKRKKSRYIVLS在血清中的剩余量由(70.52±1.55)%提高至(77.90±1.19)%(P0.01),24h后在血清中的剩余量由(56.04±1.81)%提高至(64.64±0.30)%(P0.01)。多肽QKRKRKKSRKKH化学修饰前后在10%血清环境下对A549细胞增殖的抑制率分别为(28.38±5.63)%、(34.25±10.90)%(P0.05);细胞活力的抑制率分别为(8.09±5.84)%、(15.07±8.09)%(P0.05);修饰后对A549细胞迁移的抑制率由(28.27±3.79)%提高至(66.78±4.43)%(P0.01)。HPLC结果显示:经化学修饰,12h后多肽QKRKRKKSRKKH在血清中的剩余量由(80.14±1.81)%提高至(82.46±0.84)%(P0.05),24h后在血清中的剩余量由(72.72±2.60)%提高至(77.43%±1.78)%(P0.05)。2.构建了原核表达载体p GEX4T-1-多肽,成功诱导表达并获得纯化的GST-多肽融合蛋白,免疫共沉淀证实VEGFR的2个亚型(VEGFR-1、VEGFR-2)均为多肽探针QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS的作用位点。3.Western Blot结果显示:多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIV LS对A549细胞中VEGFR-1和VEGFR-2的磷酸化水平未见明显影响。4.si RNA技术成功沉默VEGF的表达,CCK-8实验证实细胞培养系统中无内、外源性VEGF时,这2条多肽仍能抑制A549细胞的增殖。5.生物信息学理论上预测多肽的候选受体包括:EGFR、Tie-2R、HGFR、VIPR-2、FLT-3、αvβ3;体外受体竞争结合实验表明多肽不能与EGFR结合。免疫共沉淀结果显示:多肽不能结合VIPR-2,但可以与Tie-2R、HGFR结合。结论1.对多肽进行保护性化学修饰后其在10%血清环境下的稳定性明显提高,其中RKRKRKKSRYIVLS的提高更为明显。2.成功诱导表达、纯化GST-多肽融合蛋白,免疫共沉淀证实VEGFR的2个亚型即VEGFR-1和VEGFR-2均是多肽的作用靶点。3.多肽对A549细胞增殖的抑制效应可能不是通过影响VEGFR-1和VEGFR-2的磷酸化水平而引起。初步实验表明多肽QKRKRKKSRKKH、RKRKRKKSRYIVLS具有多靶点,除VEGFR-1及VEGFR-2外,HGFR、TIE-2R也是其作用靶点。
【关键词】：多肽 分子探针 肿瘤靶向 受体 血管内皮生长因子
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.4
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 肿瘤分子探针的化学修饰14-27
• 2.1 实验材料14-15
• 2.2 实验方法15-18
• 2.3 实验结果18-25
• 2.4 讨论25-27
• 第三章 肿瘤分子探针作用靶点的初步鉴定27-50
• 3.1 实验材料27-29
• 3.2 实验方法29-35
• 3.3 实验结果35-47
• 3.4 讨论47-50
• 全文结论50-51
• 参考文献51-54
• 文献综述 VEGF/VEGFRs与肿瘤的抗血管生成治疗及肿瘤核素显像54-69
• 参考文献64-69
• 攻读硕士学位期间发表的论文69-70
• 致谢70

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本文编号：516734