启动子区甲基化对肝癌细胞miRNA-214表达及细胞增殖活性的影响

发布时间：2017-07-06 00:02

  本文关键词：启动子区甲基化对肝癌细胞miRNA-214表达及细胞增殖活性的影响

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【摘要】：研究目的：研究肝癌细胞株miRNA-214启动子区的甲基化状态。在不同浓度下,甲基转移酶抑制剂对其启动子区甲基化及miRNA-214的影响,进一步分析该RNA甲基化抑制对肝癌细胞系增殖的影响。研究方法：运用生物信息学在线软件预测miRNA-214启动子区域及CpG位点；提取L0-2、Huh7、HepG2和QSG-7701四种肝细胞株DNA,通过亚硫酸氢盐测序法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)分析该mi-RNA CpG位点的甲基化;使用0umol/L,5umol/L和10umol/L三种不同浓度的甲基转移酶抑制剂(5-Aza-CdR)干扰肝细胞株启动子区甲基化,并通过RT-PCR方法检测不同浓度处理组的miRNA-214表达；通过细胞增殖实验检测以上三种浓度下抑制剂对肝细胞增殖的影响。研究结果：(1)根据BSP计算,miRNA-214启动子区甲基化频率,未处理组结果显示, L0-2、Huh7、HepG2和QSG-7701四种肝细胞的启动子区甲基化程度分别为51.42%、80.00%、60.00%和68.57%。与正常肝细胞(L0-2)比较,肝癌细胞(Huh7、HepG2和QSG-7701)的miRNA-214启动子区甲基化程度均明显升高,差异有明显差异(F=25.9,p(0.001)。(2)经PCR检测,未处理组4种肝细胞(L0-2、Huh7、HepG2和QSG-7701)的miRNA-214表达量分别为2.84±0.52、1.00±0.08、1.00±0.06和1.00±0.12。与正常肝细胞比较,三种肝癌细胞的miRNA-214表达水平较低,结果具有统计学意义(F=35.39,p0.001).在5umol/L和10umol/L两种浓度下,处理组四种肝细胞miRNA-214表达水平分别为1.66±0.06、0.58±0.12、0.73±0.13和0.83_±0.04；1.00±0.29、0.34±0.07、0.10±0.01和0.30±0.06。随着干扰素浓度升高,四种肝细胞的miRNA-214表达水平降低。三个递增浓度处理组比较,miRNA-214表达具有统计学意义(F=21.9,p0.001；F=40.5,p＜0.001;F=98.1,p＜0.001;F=61.6,p0.001)。(3)细胞增殖实验中,未处理组4种肝细胞系(L0-2、Huh7、HepG2和QSG-7701)增殖水平分别为0.18±0.03、0.81±0.61、0.68±0.28和3.79±0.16;在5μmol/L和10μmol/L浓度下,处理组肝细胞(L0-2、Huh7、 HepG2和QSG-7701)增殖水平为0.17±0.07、1.14±0.76、0.42±0.18和2.70±0.107；0.16±0.04、1.55±0.87、0.37±0.19和0.45±0.37。与正常肝细胞比较,Huh7细胞经去甲基化处理后细胞增殖活性增加(F=72.89,p0.05),HepG2细胞和QSG-7701经去甲基化处理后细胞增殖活性略降低(F=95.36,p0.05;F=381.46,p0.05),差异具有统计学意义。研究结论：通过BSP计算,我们发现3种肝癌细胞均呈现miRNA-214启动子区高甲基化。经不同浓度甲基化转移酶抑制剂干扰处理,肝癌细胞miRNA-214启动子区甲基化显著下降,miRNA-214表达水平降低,但是促进了肝癌细胞增殖。我们的结果证实,DNA甲基化可调控肝癌细胞中miRNA-214的表达,进一步影响肝癌的进展。
【关键词】：肝癌 启动子 甲基化 miRNA-214
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 个人简历3-6
• 英文缩略词索引6-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-18
• 一、材料与方法18-32
• 1 实验材料18-21
• 1.1 主要仪器设备18-19
• 1.2 细胞19
• 1.3 主要试剂19
• 1.4 常用试剂的配制19-21
• 1.5 生物信息学分析21
• 2 实验方法21-31
• 2.1 启动子区域的生物信息学分析21-22
• 2.2 细胞培养22
• 2.3 miRNA-214启动子区甲基化水平检测22-28
• 2.4 miRNA-214的定量检测28-31
• 2.5 细胞增殖活性检测31
• 3 统计学处理31-32
• 二、结果32-36
• 1 启动子区域的生物信息学分析32-33
• 1.1 CpG岛位置32
• 1.2 BSP引物32-33
• 1.3 基因组DNA的提取结果33
• 2 启动子CpG位点甲基化状态分析33-34
• 3 甲基转移酶抑制剂对启动子甲基化的影响34
• 4 5-Aza-CdR对不同肝细胞系miRNA-214表达水平的影响34-36
• 5 5-Aza-CdR对不同肝细胞系细胞增殖的影响36
• 三、讨论36-40
• 1. 去甲基化对miRNA-214启动子区甲基化程度的分析38-39
• 2. 去甲基化对miRNA-214表达水平的分析39
• 3. 去甲基化对细胞增殖活性的分析39-40
• 4. 问题与展望40
• 四、结论40-41
• 参考文献41-49
• 综述49-65
• 参考文献57-65
• 致谢65-66
• 攻读学位期间发表及待发表的文章66

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2 刘柳;启动子区甲基化对肝癌细胞miRNA-214表达及细胞增殖活性的影响[D];广西医科大学;2016年

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本文编号：524028