ARNO介导BCR-ABL-ARF6信号及促进慢性粒细胞白血病细胞耐药的初步研究

发布时间：2017-07-06 02:04

  本文关键词：ARNO介导BCR-ABL-ARF6信号及促进慢性粒细胞白血病细胞耐药的初步研究

  更多相关文章： 慢性粒细胞白血病 ARNO ARF6 耐药

【摘要】：背景:慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一种粒细胞增生性疾病,占成人白血病的20%。CML病人的主要病因是9号和22号染色体易位产生BCR-ABL融合基因,编码一个210k Da持续活化的酪氨酸激酶,诱导CML的产生。针对BCR-ABL开发的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)类靶向药物(譬如Imatinib)取得了较好的临床疗效,已经取代骨髓移植成为首选治疗方案。但Imatinib并不能治愈CML,长期服用Imatinib容易引起BCR-ABL基因突变和耐药基因的高表达而对药物产生抗性,使CML从慢性期进入加速期,或转为急性白血病使病情难以控制,因此,阐明CML的耐药机制或发现新的药物靶点对未来CML的诊疗具有重要意义。ADP核糖基化因子(ADP-ribosylation factors,ARFs)是真核细胞中广泛表达且高度保守的GTP结合蛋白,是Ras超家族成员之一。先前的实验中,将Arf6进行干扰,降低K562细胞中ARF6蛋白的表达,发现K562细胞的增殖和耐药能力显著下降。所以我们初步推测ARF6在BCR-ABL诱导的CML中发挥着关键作用。ARNO(ARF nucleotide-binding-site opener)是目前报道最多的催化ARF6的鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs)。我们通过RT-PCR检测了RNA水平K562中ARF6活化所需的GEFs表达。在四种GEFs蛋白(Cytohesin 1、ARNO、Grp1和Cytohesin 4)中,ARNO的表达量明显高于其他蛋白,提示在CML中,起催化作用的可能也是ARNO。我们结合预实验的结果和国内外文献报道,对ARF6上游和下游的信号转导通路进行了归纳和预测,BCR-ABL通过磷酸化ARNO促进了ARF6的活化,介导下游信号通路,调控靶基因(c-myc、cyclin B1、p21、MDR1和TERT等)的表达,进而促进CML的增殖与耐药。为了验证这种推测,本课题构建了有ARNO突变体(Y6F、Y326F、Y381F、E156K)的真核表达载体,转染293T细胞,通过co-IP、Western blot等方法阐明BCR-ABL磷酸化ARNO促进ARF6活化的分子机制。另外用Secin H3(ARNO抑制剂)处理K562细胞,检测了ARNO对K562细胞耐药的影响。方法:1.利用点突变试剂盒构建ARNO突变质粒表达载体,和BCR-ABL表达载体共同转染293T细胞。2.利用co-IP、Western blot检测ARNO的磷酸化水平,ARF6-GTP 水平。3.Secin H3处理K562细胞,利用流式细胞术检测ARNO对K562细胞耐药的影响。结果:1.co-IP、Western blot结果显示在三种ARNO突变体中,Y326F突变体的ARNO磷酸化水平和Arf6-GTP较低,与阴性对照E156K相似,推测BCR-ABL磷酸化ARNO的326位酪氨酸进而活化ARF6。2.流式细胞术结果显示K562细胞经Secin H3处理后细胞凋亡率明显增加,对Imatinib的耐药性减弱,说明Secin H3抑制ARNO的活性后增强了Imatinib的药效,ARNO使K562对Imatinib的敏感性增强。结论:BCR-ABL磷酸化ARNO的326位酪氨酸进而活化ARF6;ARNO使K562对Imatinib的敏感性增强。
【关键词】：慢性粒细胞白血病 ARNO ARF6 耐药
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.72
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-17
• 1.1 慢性粒细胞白血病简介11-12
• 1.1.1 CML的治疗进展11
• 1.1.2 CML的耐药研究11-12
• 1.2 ARNO的研究进展12-14
• 1.2.1 ARNO在上皮细胞转型中的作用12-13
• 1.2.2 ARNO在RalBP1/RLIP76通路介导的细胞迁移中的作用13-14
• 1.2.3 ARNO在结肠癌中的作用14
• 1.3 ARF6的研究进展14-15
• 1.4 ARNO-ARF6与慢性粒细胞白血病15-17
• 第2章 材料与方法17-37
• 2.1 实验材料17-20
• 2.1.1 主要生化和分子生物学试剂17-19
• 2.1.2 器材和主要仪器19-20
• 2.1.3 细胞20
• 2.1.4 质粒及载体20
• 2.2 实验方法20-37
• 2.2.1 PCR方法检测K562和 293T细胞ARNO基因20-22
• 2.2.2 Netphos2.0 Server软件分析ARNO酪氨酸磷酸化位点22
• 2.2.3 ARNO表达载体的构建22-25
• 2.2.4 ARNO表达载体的点突变25-26
• 2.2.5 构建MSCV-puro-ARNO载体26-28
• 2.2.6 验证MSCV-puro-ARNO载体的表达28-32
• 2.2.7 MigrI-BCR-ABL和MSCV-puro-ARNO共转染 293T细胞32-33
• 2.2.8 ARNO对K562细胞耐药的影响33-34
• 2.2.9 构建pLenti-III-ubc-ARNO重组载体34-35
• 2.2.10 验证pLenti-III-ubc-ARNO载体在 293T细胞的表达35-36
• 2.2.11 包装ubc-ARNO慢病毒36-37
• 第3章 实验结果37-47
• 3.1 ARNO在K562中的表达及磷酸化位点的预测37-38
• 3.2 ARNO突变体的构建（以突变体Y381F为例）38-41
• 3.3 ARNO突变载体的验证41-42
• 3.4 ARNO磷酸化位点的确定42-45
• 3.5 ARNO活性的抑制增强IMATINIB的药效45
• 3.6 ARNO慢病毒载体的构建45-47
• 第4章 讨论47-50
• 第5章 结论50-51
• 参考文献51-57
• 致谢57

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 郑晨宏;梁后杰;周琪;;黏附分子在肿瘤多细胞耐药中的研究进展[J];肿瘤;2008年07期

2 周中军，，金顺钱，罗贤懋，陈凤，魏慧娟;谷胱甘肽－硫转移酶在肺癌细胞耐药中的作用[J];生物化学杂志;1996年02期

3 梁后杰;重视对肿瘤多细胞耐药的研究[J];重庆医学;2003年03期

4 梁后杰,黄海辉;细胞粘附与肿瘤多细胞耐药[J];第三军医大学学报;2002年11期

5 梁后杰,黄海辉;细胞黏附介导的肿瘤多细胞耐药[J];中华医学杂志;2004年24期

6 张敏;吴耀辉;陈智超;游泳;邹萍;;Chk1在K562/A02细胞耐药中的作用机制[J];华中科技大学学报(医学版);2008年05期

7 丁玉峰,胡群;白血病细胞耐药的分子机制和药物逆转[J];中国药师;2005年02期

8 肖洁;尹松梅;谢双锋;聂大年;李益清;马丽萍;王秀菊;冯坚红;;细胞调控因子SKP2的表达与HL-60/A耐药的关系[J];中山大学学报(医学科学版);2009年02期

9 敖绪军;安江宏;钱莘;卓文磊;孙建国;陈正堂;;Sca-1~+Lewis肺癌细胞耐药实验研究[J];四川医学;2008年05期

10 黄伟,张瑶珍,李登举,周剑锋;线粒体参与HL-60细胞耐药机制的研究[J];华中科技大学学报(医学版);2005年03期

中国重要会议论文全文数据库 前9条

1 王晓芳;王椿;秦尤文;颜式可;高彦荣;蔡琦;;联合抑制泵蛋白和抗凋亡蛋白逆转HL-60/ADR细胞耐药[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

2 张嵩;刘晓力;杜庆锋;樊伟;;STI571诱导K562细胞耐药的实验研究[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年

3 朴瑛;刘丽梅;周凡;刘彦琴;刘景华;白颖;;Bcl-2小干扰RNA对HL-60/VCR细胞耐药性逆转的研究[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

4 张嵩;刘晓力;杜庆锋;樊伟;;STI571诱导K562细胞耐药的实验研究[A];第10届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2005年

5 陈信义;郑智;侯丽;李冬云;;复方浙贝颗粒联合阿霉素影响K562/A02移植瘤细胞耐药相关酶表达研究[A];2009年首届全国中西医肿瘤博士及中青年医师论坛论文集[C];2009年

6 冯戈;王大章;何嘉;冷卫东;郑光勇;陈槐卿;;舌癌Tca8113细胞耐药裸鼠诱发瘤模型的探讨[A];第二届全国口腔颌面—头颈肿瘤内科综合治疗研讨会论文汇编[C];2006年

7 杨永红;李惠芳;石永进;王逸群;张英;王奕嘉;朱平;;转mdrl基因诱导CIK细胞耐药并保持肿瘤杀伤活性[A];第三届全国血液免疫学学术大会论文集[C];2003年

8 杨永红;李惠芳;石永进;王逸群;张英;朱平;;转MDR1基因诱导CIK细胞耐药并保持肿瘤杀伤活性[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

9 张毅;王小燕;闫海钊;刘雨婷;蔡君;王怀玲;王一飞;;Hsp90抑制剂BJ-B11逆转白血病干细胞耐药的机制研究[A];广东省生物物理学会2013年学术研讨会论文集[C];2013年

中国博士学位论文全文数据库 前5条

1 赵宝霞;EGFR突变型NSCLC的EGFR-TKI耐药机制体外研究[D];大连医科大学;2013年

2 夏青;DATS逆转K562/A02细胞耐药的机制研究[D];山东大学;2012年

3 白庆咸;bcl-x基因在恶性淋巴造血组织的表达及其对白血病细胞凋亡易感性与化疗敏感性的影响[D];第四军医大学;1998年

4 王以;药物转运细胞模型的建立、应用和相关机制的初步研究[D];浙江大学;2005年

5 高爱丽;大环内酯类化合物逆转肿瘤细胞（MCF-7/adr）多药耐药性的研究[D];东北农业大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 彭方毅;模拟缺血再灌注损伤诱导Hepg2细胞多药耐药相关基因与蛋白的表达及意义[D];四川医科大学;2015年

2 李丽君;胞质M-CSF通过抑制HIF-1α/BNIP3/Bax信号通路增强乳腺癌MCF-7细胞的凋亡抗性[D];南华大学;2015年

3 张建一;酸性丝氨酸蛋白酶ASP_(NJ)抗急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞作用与膜蛋白表达相关机制[D];吉林大学;2016年

4 徐倩;ARNO介导BCR-ABL-ARF6信号及促进慢性粒细胞白血病细胞耐药的初步研究[D];吉林大学;2016年

5 李娟;血管内皮细胞生长因子调节肿瘤细胞多药耐药相关蛋白1表达的研究[D];江苏大学;2010年

6 高飞;拓扑异构酶Ⅱα的表达对人肺癌细胞耐药的影响[D];大连医科大学;2010年

7 谢佳;DSCs细胞的生物学特性及对裸鼠移植瘤的影响[D];重庆医科大学;2014年

8 黄海辉;E-钙粘素及PI3K信号转导通路在肿瘤多细胞耐药中作用机制的研究[D];第三军医大学;2003年

9 高燕芳;iASPP和CDKL1的表达及其沉默对肿瘤细胞生物活性的影响[D];南京医科大学;2012年

10 张嵩;STI571诱导K562细胞耐药机制的研究[D];第一军医大学;2005年

本文编号：524338