SEPP1高甲基化在VHL野生型肾透明细胞癌发生中的作用和机制研究

发布时间：2017-07-07 02:00

  本文关键词：SEPP1高甲基化在VHL野生型肾透明细胞癌发生中的作用和机制研究

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【摘要】：目的：1.利用基因芯片技术筛选出在VHL野生型和VHL突变型的肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)中甲基化程度及表达程度均有差异的基因,在ccRCC原代培养细胞及肿瘤组织中对差异进行验证。2.构建目的基因表达载体及稳转细胞株,通过一系列功能试验研究目的基因在ccRCC的发生中发挥的功能,对VHL野生型肾透明细胞癌的发生机制进行补充。方法：1.对ccRCC的新鲜肿瘤组织进行细胞传代培养,在得到的稳定传代培养的肿瘤细胞株中(均进行过str鉴定)根据患者性别、年龄、肿瘤的Fur man分级、肿瘤直径进行配对分组，筛选出5例VHL突变及5例VHL野生型的ccRCC.提取这10个ccRCC的总RNA，，进行Affymetrix HTA2.0表达谱芯片检测;提取这10个ccRCC的总DNA,进行Illumina 450K甲基化芯片检测。2.提取20例VHL突变和20例VHL野生型的原代培养细胞的总RNA,逆转成cDNA,利用RT-PCR的方法验证表达谱芯片结果。3.提取20例VHL突变和20例VHL野生型的原代培养细胞的总DNA并进行硫化,利用甲基化特异性PCR的方法验证甲基化芯片结果。4.使用Sequenom MassArray甲基化检测方法检测目标基因CpG岛甲基化程度。5.使用Western-blot及免疫组化方法检测目标基因SEPP1在VHL突变和VHL野生型ccRCC组织中的表达情况。6.以人胚肾细胞株293T细胞的cDNA作为模板,通过PCR方法获得人SEPP1全长序列片段,并与慢病毒表达载体plv-EGFP(2A) Puro质粒相连接,获得重组plv-EGFP(2A)Puro-SEPP1载体并进行基因测序验证。将重组慢病毒载体与包装质粒共同转染293T细胞,进行病毒包装。用病毒上清感染肾透明细胞癌细胞株786-O和769-P,得到稳转细胞株。7.使用Western blot方法检测SEPP1蛋白表达情况。按照重组慢病毒载体感染细胞株、空载体感染细胞株、未经感染细胞株进行分组,并通过MTS检测法、细胞平板克隆形成实验、细胞周期试验对细胞的增殖能力进行评估。结果：1.表达谱芯片中筛选出80个差异倍数大于1.5且P0.05的编码基因,在其中筛选出12个改变倍数2的编码基因并利用RT-PCR在原代培养细胞中进行验证，结合文献报道及基因已知的功能,选择SLC34A2, CXCL5, SULT1C4, AKAP12, SEPP1进行验证。2.从甲基化芯片中选择甲基化改变明显且在表达谱芯片中存在差异的四个基因：SLUT1C4,SEPP1、SLC34A2和AKAP12,利用MSP 和 Sequenom MassARRAY甲基化检测，其中SEPP1在VHL突变型和VHL野生型ccRCC中的甲基化差异得到验证。3.利用western-blot和免疫组化方法,SEPPI的表达差异在组织中得到验证。4plv-EGFP(2A)Puro-SEPP1重组慢病毒表达载体构建成功,经其感染的786-O、769-P细胞株在转染48h后在荧光显微镜下可见绿色荧光表达显著，SEPP1 蛋白表达水平均明显提高。5.MTS实验结果提示plv-EGFP(2A)Puro-SEP P1感染组的细胞增殖能力降低(P0.01)。6.平板克隆形成实验结果显示,SEPPI过表达细胞系集落形成能力明显降低(P0.001)。7.周期试验提示SEPP1过表达引起肾癌细胞G2/M期阻滞。结论：1、利用芯片技术及多个验证试验筛选出在VHL突变型和VHL野生型ccRCC中甲基化水平和表达水平均存在差异的基因SEPP1。2、成功构建重组慢病毒表达载体plv-EGFP(2A)Puro-SEPP1,在786-O、769-P细胞株中过表达的SEPP1可引起细胞周期G2/M期阻滞,并显著降低细胞增殖能力。
【关键词】：肾透明细胞癌 DNA甲基化 VHL基因 Affymetrix HTA2.0表达谱芯片 Illumina 450K甲基化芯片 SEPP1基因 硒蛋白P 慢病毒表达载体 肿瘤增殖
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-10
• 前言10-12
• 第一部分 VHL野生型与VHL突变型肾透明细胞癌中差异表达基因的筛选髓证及甲基化水平检测12-36
• 1. 材料与方法12-28
• 2. 结果28-35
• 3. 小结35-36
• 第二部分 SEPP1基因慢病毒过表达载体构建及其在肾透明细胞癌细胞中的功能研究36-45
• 1. 材料与方法36-40
• 2. 结果40-44
• 3. 小结44-45
• 讨论及结论45-48
• 参考文献48-51
• 综述：DNA甲基化在肾癌发生、诊断和治疗中的作用及前景51-63
• 参考文献56-63
• 英文缩略词表63-64
• 攻读学位期间发表论文64-65
• 致谢65-66

本文编号：528444