ICOS miR-SNP与结直肠癌发生发展及其机制的初步研究

发布时间：2017-07-07 19:17

  本文关键词：ICOS miR-SNP与结直肠癌发生发展及其机制的初步研究

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【摘要】：第一部分ICOS miR-SNP与结直肠癌发生发展的相关性研究[目的]探讨ICOS基因3’-UTR内的miR-SNP与结直肠癌发生发展的相关性。[方法]1、运用生物信息学软件筛选出位于ICOS基因3'-UTR内的SNP位点及可能存在的miRNA结合位点；选择位于预测的miRNA结合位点内的,且较小等位基因频率(MAF)大于10%的SNP进行研究。2、收集382例结直肠癌患者及714例正常人的外周血样本,从中提取DNA,通过高通量SNP基因分型来检测SNP的基因型分布。3、分析不同基因型与结直肠癌发生发展及临床病理参数的关系。[结果]1、从SNP数据库中找到符合条件的SNP有：rs10183087、rs4404254,rs1559931和rs4675379；能与之结合的miRNA分别有：rs10183087位点位于miR-587和miR-3180-5p的结合靶点内；rs4404254位点位于miR-186-5p、miR-520d-5p、 miR-524-5p、miR-548b-3p、miR-1276和miR-3133的结合靶点内；rs1559931位点位于miR-587、miR-1279和miR-3692-3p的结合靶点内；rs4675379位点位于miR-182-3p、miR-323b-5p、miR-2117、miR-2355-3p和miR-4279的结合靶点内。2、成功检测到基因型分布的SNP有：rs4404254 TC, rs1559931 GA和rs4675379 GC。3、数据分析显示,在结直肠癌患者中,rs4404254的CC型纯合子所占比例明显低于占主导地位的TT型纯合子(0.8%vs 2.1%；OR=0.35),而TC杂合子(21.3%vs 27.6%；OR=0.70)和C等位基因携带者(22.1% vs 29.7%；OR=0.58)所占比例同样明显低于TT型纯合子。rs1559931的AA纯合子所占比例明显低于占主导地位的GG型纯合子(1.1% vs 2.2%；OR=0.46),而GA杂合子(21.0% vs 27.2%；OR=0.70)和A等位基因携带者(22.1% vs 29.4%；OR=0.60)所占比例明显低于GG型纯合子。与GG纯合子相较,rs4675379的A等位基因携带者在患者组中明显少见(18.0%vs 22.0%；OR=0.66)。ICOS miR-SNPs与结直肠癌的临床病理参数间无相关性。[结论]SNP位点rs4404254、rs 1559931和rs4675379与结直肠癌的发生显著相关,其C等位基因,A等位基因和C等位基因可能是结直肠癌的保护性因素。第二部分ICOS miR-SN P对ICOS表达调控机制的研究[目的]研究ICOS基因3'-UTR上的SNP位点对miRNA的调控作用。[方法]1、构建野生型ICOS/3'-UTR/pGL3重组荧光素酶表达载体和突变型ICOS/3'-UTR/pGL3重组荧光素酶表达载体：(rs4404254 CC型、rs1559931AA型和rs4675379 CC型)。2、将构建好的载体和各自相对应miRNA共同转染CHO细胞,并用双荧光素酶报告系统测定基因活性。3、运用统计学软件分析各SNP位点对miRNA的调控作用。4、通过western blot进一步验证miR-SN P对于miRNA的调控作用。[结果]1、rs4404254T等位基因特异性的ICOS/3'-UTR/pGL3载体的表达被miR-186-5p显著抑制(p=0.0072)。rs1559931 G等位基因特异性的ICOS/3'-UTR/pGL3载体的表达能被niR-1279 (p=0.0026)和miR-3692-3p (p=0.0023)显著抑制。rs4675379 C等位基因特异性的ICOS/3'-UTR/pGL3载体的表达能被,niR-323b-5p(p= 8.27×105)显著抑制；而rs4675379 G等位基因特异性的ICOS/3'-UTR/pGL3载体的表达能被miR-2117(p=0.03)显著抑制。[结论]ICOS基因3’-UTR内的SNP位点rs4404254TC, rsl559931 GA 和rs4675379GC在一定程度上可通过由1niR-186-5p, miR-323b-5p, miR-1279, miR-2117 和miR-3692-3p介导的调控机制来影响ICOS分子的表达,从而改变结直肠癌的易感性。[结论]SNP位点rs4404254、rs 1559931和rs4675379与结直肠癌的发生显著相关,其C等位基因,A等位基因和C等位基因可能是结直肠癌的保护性因素。第二部分ICOS miR-SN P对ICOS表达调控机制的研究[目的]研究ICOS基因3'-UTR上的SNP位点对miRNA的调控作用。[方法]1、构建野生型ICOS/3'-UTR/pGL3重组荧光素酶表达载体和突变型ICOS/3'-UTR/pGL3重组荧光素酶表达载体：(rs4404254 CC型、rs1559931AA型和rs4675379 CC型)。2、将构建好的载体和各自相对应miRNA共同转染CHO细胞,并用双荧光素酶报告系统测定基因活性。3、运用统计学软件分析各SNP位点对miRNA的调控作用。4、通过western blot进一步验证miR-SN P对于miRNA的调控作用。[结果]1、rs4404254T等位基因特异性的ICOS/3'-UTR/pGL3载体的表达被miR-186-5p显著抑制(p=0.0072)。rs1559931 G等位基因特异性的ICOS/3'-UTR/pGL3载体的表达能被niR-1279 (p=0.0026)和miR-3692-3p (p=0.0023)显著抑制。rs4675379 C等位基因特异性的ICOS/3'-UTR/pGL3载体的表达能被,niR-323b-5p(p= 8.27×105)显著抑制；而rs4675379 G等位基因特异性的ICOS/3'-UTR/pGL3载体的表达能被miR-2117(p=0.03)显著抑制。[结论]ICOS基因3’-UTR内的SNP位点rs4404254TC, rsl559931 GA 和rs4675379GC在一定程度上可通过由1niR-186-5p, miR-323b-5p, miR-1279, miR-2117 和miR-3692-3p介导的调控机制来影响ICOS分子的表达,从而改变结直肠癌的易感性。小结本论文主要探讨了ICOS基因3’-UTR内的miR-SNP与结直肠癌发生发展的相关性及引起此种相关性的调控机制。研究发现,在结直肠癌患者中,rs4404254的CC型,TC型和C等位基因携带者所占比例明显偏低；rs1559931的AA型,GA型和A等位基因携带者所占比例明显偏低；rs4675379的A等位基因携带者在患者组中明显少见。故rs4404254的C等位基因,rs1559931的A等位基因和rs4675379的C等位基因可能对结直肠癌的发生起保护作用。同时通过体外功能研究发现,rs4404254的C等位基因,rs1559931的A等位基因和rs4675379的C等位基因通过减弱miRNAs和ICOS上3'-UTR的结合力度,上调T细胞上ICOS受体的表达,从而减少个体结直肠癌的发生率。这为寻找结直肠癌的遗传病因及阐明miRSNP影响结直肠癌易感性的机制提供了新的视角。
【关键词】：结直肠癌 ICOS 单核苷酸多态性 microRNA
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 研究背景11-16
• 一、结直肠癌(colorectal cancer,CRC)11
• 二、肿瘤微环境11
• 三、ICOS及其受体分子11-12
• 四、microRNA12
• 五、单核苷酸多态性12-13
• 六、miR-SNP13
• 参考文献13-16
• 第一部分 ICOS基因3’-UTR内的单核苷酸多态性与结直肠癌发生发展的相关性研究16-33
• 一、试剂与材料16-18
• 二、实验方法18-21
• 三、实验结果21-29
• 四、讨论29-30
• 参考文献30-33
• 第二部分 ICOS miR-SNP对ICOS表达调控的机制研究33-50
• 一、试剂与材料33-37
• 二、实验方法37-43
• 三、实验结果43-47
• 四、讨论47-48
• 参考文献48-50
• 结论50-51
• 综述51-58
• 参考文献55-58
• 攻读硕士学位期间发表的论文58-59
• 本研究所获的基金资助59-60
• 缩写词表60-61
• 致谢61

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本文编号：531489