SCIN促进胃癌细胞侵袭机制及胃肠道间质瘤细胞系的建立

发布时间：2017-07-14 10:10

  本文关键词：SCIN促进胃癌细胞侵袭机制及胃肠道间质瘤细胞系的建立

  更多相关文章： 胃癌 侵袭转移 肌切蛋白 伪足 Cdc42 胃肠道间质瘤 原代培养 CD117 CD34 DOG-1 伊马替尼 倍增周期

【摘要】：第一部分摘要 SCIN促进胃癌细胞侵袭机制研究研究背景与研究目的:胃癌在全世界范围内,其发病率排在所有肿瘤的第四位,而死亡率则位居所有肿瘤相关死亡原因的第二位。尽管由于近年来手术技术的发展、放化疗的应用以及早期诊断的增多,胃癌的死亡率有所下降,但是进展期胃癌患者的生存率仍然很低。许多胃癌患者在经过根治手术以及化疗后,仍然会有复发及转移,而在胃癌发生复发或转移后,其治疗更加困难,手术难度加大。而胃癌细胞的侵袭转移是目前对其治疗的最大难关,目前对胃癌侵袭转移的具体分子机制仍然不甚明了,故阐明胃癌细胞侵袭转移的具体分子机制对胃癌的治疗意义重大。我们课题组前期研究已经表明,SCIN在胃癌组织中存在表达,且表达明显高于癌旁组织,SCIN的表达与患者预后存在明显相关性,SCIN高表达的胃癌患者预后明显差于低表达者,SCIN还具有促进胃癌细胞侵袭转移和成瘤的能力,但是其中的具体分子机制和通路仍然未知。本研究旨在阐明SCIN促进胃癌细胞侵袭和转移能力的具体机制,并探讨SCIN作为胃癌预后指标及成为治疗靶点的可能性。主要材料及方法:1.通过免疫荧光染色的方法来观察在敲低SCIN后,胃癌细胞系MGC803和原代胃癌细胞XN0422的伪足形成能力的变化情况。2.通过q RT-PCR检测敲低SCIN后胃癌细胞系MGC803和原代胃癌细胞XN0422中Cdc42分子RNA表达的改变。3.通过Western blotting检测在敲低SCIN后,胃癌细胞系MGC803和胃癌原代细胞XN0422中Cdc42分子蛋白表达的改变。主要研究结果:1.免疫荧光染色发现,在胃癌细胞系MGC803和原代胃癌细胞XN0422中敲低SCIN后,两种细胞均能观察到敲低组细胞的伪足数量较对照组明显减少。2.通过q RT-PCR检测胃癌细胞系MGC803和原代胃癌细胞XN0422中敲低SCIN后,两种细胞的敲低组Cdc42的RNA表达减少,且较对照组减少约50%。3.通过Western blotting检测胃癌细胞系MGC803和原代胃癌细胞XN0422中敲低SCIN后,两种细胞的敲低组Cdc42的蛋白表达均较对照组减少,而蛋白表达减少量较RNA表达减少量更加明显。主要结论:1.伪足形成能力的改变参与了SCIN促进胃癌细胞的侵袭转移过程。2.敲低SCIN可以降低胃癌细胞中Cdc42的RNA和蛋白质表达量,说明SCIN对伪足形成的调控作用是通过对Cdc42的调控而实现。第二部分摘要 胃肠道间质瘤细胞系的建立及特性鉴定研究背景与研究目的:胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)是胃肠道最常见的间叶源性肿瘤,起源于胃肠道间质的Cajar细胞,其发病率约为每年10~20/10万。胃肠道间质瘤主要发生于胃(50%~70%),其次为小肠(20%~30%),其他发病部位可包括食管,结直肠甚至消化道外的其他部位(小于10%)。目前原发性胃肠道间质瘤的主要治疗方法是手术切除并配合术后伊马替尼进行靶向治疗。c-kit基因(75% 85%)或者PDGFRA基因(platelet-derived growth factor receptor alpha;5% 7%)发生功能获得性突变是大多数胃肠道间质瘤发病的始动因素,进而使酪氨酸激酶持续激活,并获得不受机体调控的增殖能力。因此胃肠道间质瘤是可以通过酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼类药物进行治疗的。然而伊马替尼也无法治愈此病,耐药后的复发是最主要因素,有多达50%的患者会发生耐药进而肿瘤复发,而发生耐药及复发的时间往往在中位治疗期2年内。尽管目前对伊马替尼耐药的部分机制有所了解,但是对其深层的分子机制仍然知之甚少。而当前对胃肠道间质瘤的研究因为缺乏合适的及容易获取的细胞系而受到限制。据我们所知,目前有公开报道的胃肠道间质瘤细胞系并不多,仅包括GIST-T1、GIST-H1以及GK1C和GK3C。我们的研究旨在建立一株胃肠道间质瘤细胞系,并对其进行相对完整的特性鉴定以使其可以广泛应用于胃肠道间质瘤的研究。主要材料及方法:1.通过组织块法对肿瘤组织进行原代细胞培养,在肿瘤细胞爬出后通过局部传代的方式富集肿瘤细胞,而后通过冻存、复苏和传代以淘汰成纤维细胞并获得稳定的胃肠道间质瘤细胞系。2.通过免疫组织化学染色的方法检测患者肿瘤组织以及移植瘤中的CD117,CD34,DOG-1,α-SMA,S-100的表达。3.通过免疫荧光染色的方法检测细胞中CD117分子的表达情况。4.通过免疫细胞化学染色方法,检测细胞中CD117,CD34,DOG-1,α-SMA,及S-100的表达。5.通过绘制生长曲线并计算倍增周期的方法以获得其增殖能力特性。通过透射电镜观察细胞微结构,通过核型鉴定分析染色体变异情况。6.通过裸鼠皮下移植瘤形成实验验证其成瘤能力。将裸鼠按照接种细胞数目分为4组:1×104组,1×105组,5×105组,1×106组。每组4只裸鼠,每只裸鼠接种一个位点。7.通过伊马替尼药物杀伤实验明确其对伊马替尼的敏感性,并计算出伊马替尼对其作用的IC50(half maximal inhibitory concentration,半抑制浓度)。8.通过对c-kit基因的第8、9、11、13、17外显子及PDGFRA基因的第12、14、18外显子测序,以明确其是否发生突变以及发生突变的位点及意义。9.所有实验至少重复3次,实验结果表述为平均值±标准差。数据分析使用SPSS 17.0统计分析软件,两组间的比较采用t检验,移植瘤重量的比较采用非参数检验,伊马替尼IC50的计算采用曲线拟合分析。主要实验结果:1.通过组织块法,成功分离并培养出胃肠道间质瘤的肿瘤细胞,而后通过传代,冻存和复苏逐步淘汰掉其中的成纤维细胞,并使其适应体外生长环境,表现出稳定的细胞形态及特性。2.对患者肿瘤组织以及裸鼠移植瘤的免疫组织化学染色分析发现,CD117(+)、CD34(+)、DOG-1(+)、α-SMA(-)、S100(-)。3.免疫荧光检测细胞中CD117的表达,结果表明CD117在此细胞中存在表达,表达主要位于细胞膜。4.通过免疫细胞化学染色的方法检测细胞中的分子表达,结果发现CD117(+)、CD34(+)、DOG-1(+)、α-SMA(-)、S100(-),同患者肿瘤组织及移植瘤检测的结果相同。5.根据实验结果绘制生长曲线,并计算得其倍增周期为24.063h。透射电镜观察细胞微结构,结果显示其细胞核明显增大,核质比增高,核膜清晰,核仁大,可有单个或双个,核形态不规则,细胞微绒毛减少或消失。通过核型鉴定检测其染色体变异情况,结果发现其染色体为亚三倍体核型的组合核型,染色体数目约为64~68条。存在涉及到Y、1、2、3、4、6、7、9、10、11、12、13、15、16、17、19、21、22等多条染色体参与的复杂数目及结构异常,包括易位、缺失、重复等。6.此细胞系具有高效的成瘤能力。移植瘤实验发现1×106组最早于接种第7天出现肉眼可见肿瘤,而1×104组最早于第13天出现肉眼可见肿瘤,3周后所有接种位点均有肉眼可见肿瘤形成,此时收割肿瘤。重量统计结果显示移植瘤重量与接种细胞数目正相关,且各组形成移植瘤的重量具有统计学差异(P0.05)。7.使用伊马替尼检测其药物敏感性并计算出IC50值,结果表明此细胞对伊马替尼许多敏感,IC50=0.5343μmol/L。8.使用外显子测序技术检测了c-kit基因的8、9、11、13、17号外显子以及PDGFRA基因的12、14、18号外显子。结果显示c-kit基因的五个外显子及PDGFRA基因的14号外显子未发生突变,而PDGFRA基因的12号外显子于1701位点发生突变,AG;18号外显子的2472位点CT。二者均为同义突变,不影响氨基酸编码。主要结论:1.成功从患者肿瘤组织中分离培养出一例胃肠道间质瘤细胞系。2.此细胞系分子表型为CD117(+)、CD34(+)、DOG-1(+)、SMA(-)、S100(-),倍增周期为24.063h。3.此细胞具备成瘤能力并对伊马替尼相对敏感,IC50=0.5343μmol/L。
【关键词】：胃癌 侵袭转移 肌切蛋白 伪足 Cdc42 胃肠道间质瘤 原代培养 CD117 CD34 DOG-1 伊马替尼 倍增周期
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 缩略语表5-6
• 英文摘要6-12
• 中文摘要12-16
• 第一部分 SCIN促进胃癌细胞侵袭机制研究16-41
• 第一章 前言16-25
• 1.1 选题缘由16-17
• 1.2 研究背景17-24
• 1.3 研究意义24-25
• 第二章 SCIN通过促进胃癌细胞伪足形成而促进侵袭转移25-32
• 2.1 实验材料25-26
• 2.2 实验方法26-28
• 2.3 实验结果28-30
• 2.4 讨论30-32
• 第三章 Cdc42在SCIN促进的胃癌细胞伪足形成中发挥重要作用32-40
• 3.1 实验材料32-34
• 3.2 实验方法34-36
• 3.3 实验结果36-38
• 3.4 讨论38-40
• 第一部分小结40-41
• 第二部分 胃肠道间质瘤细胞系的建立41-67
• 第一章 前言41-43
• 1.1 研究背景41-42
• 1.2 研究意义42-43
• 第二章 胃肠道间质瘤细胞系的分离与培养43-49
• 2.1 实验材料43-44
• 2.2 实验方法44-45
• 2.3 实验结果45-47
• 2.4 讨论47-49
• 第三章 胃肠道间质瘤细胞系特性的鉴定49-66
• 3.1 实验材料49-50
• 3.2 实验方法50-57
• 3.3 实验结果57-64
• 3.4 讨论64-66
• 第二部分小结66-67
• 参考文献67-74
• 文献综述 胃肠道间质瘤的生物学特征及诊断和治疗进展74-85
• 参考文献81-85
• 攻读学位期间研究成果85-86
• 致谢86

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本文编号：540651