HPIP对肿瘤细胞自噬功能的影响及与LC3B的相互作用

发布时间：2017-07-17 10:33

  本文关键词：HPIP对肿瘤细胞自噬功能的影响及与LC3B的相互作用

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【摘要】：目的：自噬(autophagy)是真核生物细胞特有的一种生命现象,实质是自噬溶酶体降解体内的大分子物质(如细胞器、蛋白质等),为细胞生存代谢提供营养物质。自噬作为Ⅱ型程序性细胞死亡(type Ⅱ programed cell death),在生物进化过程中具有高度保守性。目前研究发现,自噬参与了多种疾病的发生,如病原体感染、神经退行性疾病、衰老、肿瘤等。我们的研究方向主要是自噬对于肿瘤的影响,体外探讨HPIP(hematopoietic pre-B-cell leukemia transcription factor-interacting protein,人造血相关的前B细胞白血病转录因子相互作用蛋白)对肿瘤细胞自噬的影响。方法：利用PCR技术从人的乳腺文库中扩增出LC3B目的基因片段全长及各分段序列,同时扩增出ATG4B目的基因片段,将这些序列插入到pGEX-KG及pET-28a(K+)载体中,构建出重组质粒；体外给予不同的自噬诱导条件,通过免疫荧光实验观察HPIP与LC3B的共定位情况；细胞核质分离实验检测HPIP与LC3B的定位；GST pull-down技术检测HPIP与LC3B的作用部位。结果：免疫共沉淀检测到HPIP蛋白与LC3B蛋白存在相互作用；免疫荧光发现HPIP与LC3B存在共定位；成功构建了不同载体的目的基因片段；蛋白水平检测HPIP对自噬有一定的影响；HPIP与ATG4B可共同作用于LC3B,且HPIP与ATG4B也存在相互作用。结论：HPIP参与了肿瘤细胞自噬过程,HPIP、LC3B与ATG4B之间两两存在相互作用,HPIP可能在自噬的ATG8泛素化结合过程中发挥作用,阻碍LC3B前体蛋白Pro-LC3B被ATG4B切割转化成LC3B-I。
【关键词】：HPIP 肿瘤 自噬 LC3B
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-3
【目录】：

• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-12
• 材料与方法12-19
• 1. 材料12-13
• 1.1 菌株与细胞株12
• 1.2 质粒12
• 1.3 分子生物学试剂盒12
• 1.4 实验用化学试剂12
• 1.5 细胞培养试剂12
• 1.6 抗体及蛋白偶联珠12-13
• 1.7 主要实验仪器13
• 2. 方法13-19
• 2.1 重组质粒的构建及鉴定表达13-14
• 2.2 质粒提取14-15
• 2.3 哺乳动物细胞的转染15
• 2.4 细胞免疫荧光15-16
• 2.5 Western Blot实验分析16
• 2.6 细胞核质分离实验16-17
• 2.7 体外蛋白纯化及提取17
• 2.8 免疫共沉淀(IP)实验17-18
• 2.9 GST pull-down实验分析18-19
• 结果19-29
• 1. 免疫共沉淀(IP实验)发现HPIP与LC3B存在相互作用19
• 2. 免疫荧光观察HPIP与LC3B的定位变化19-20
• 3. 细胞核质实验分离检测HPIP与LC3B的定位20-22
• 3.1 肿瘤细胞中内源性LC3B的分布20-21
• 3.2 过表达HPIP基因的稳定克隆细胞系中LC3B的分布21-22
• 4. 自噬干预条件下,HPIP与LC3B的定位22-24
• 4.1 自噬条件的选择22-23
• 4.2 自噬诱导下,HPIP与LC3B的定位23-24
• 5. 自噬干预下,HPIP对自噬的作用24-25
• 6. HPIP与P62之间的相互作用关系25-26
• 7. HPIP与ATG4B对LC3B有竞争性作用26-29
• 7.1 HPIP与LC3B、ATG4B与LC3B之间的相互作用26-27
• 7.2 HPIP与ATG4B之间的相互作用27-28
• 7.3 HPIP与ATG4B均可与LC3B(151-377bp)结合28-29
• 讨论29-32
• 结论32-33
• 参考文献33-37
• 文献综述37-48
• 参考文献43-48
• 附录 (缩略词表)48-50
• 攻读硕士期间发表论文50-51
• 致谢51

【共引文献】

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本文编号：553199