卵巢癌相关抗原CA125胶体金免疫层析检测方法的初步建立

发布时间：2017-07-19 09:37

  本文关键词：卵巢癌相关抗原CA125胶体金免疫层析检测方法的初步建立

  更多相关文章： CA125 胶体金免疫层析 卵巢癌

【摘要】：卵巢癌是女性生殖器最常见的三大恶性肿瘤之一,因其发病初期无典型临床症状,多数患者就诊时已处于患病晚期。因此,如何在卵巢癌发病早期准确诊断就显得尤为重要。研究发现,糖类抗原125(Carbohydrate antigen 125,CA125)作为妇科临床最常用的血清型肿瘤标志物,对上皮性卵巢癌具有一定的特异性和敏感性,在卵巢癌的预防、辅助诊断、病情评估以及术后疗效等方面具有非常积极的意义,可作为卵巢癌防治的主要监测指标。目前CA125的检测技术主要有化学发光法及酶联免疫法等,所使用的检测试剂盒大多为昂贵的进口或国内分装试剂,且检测时均需依赖相关检测仪器在实验室进行,检测成本较高,不适合于基层医院进行大规模初筛和床旁快检。因此,急需寻找一种简便、快速的检测技术,为临床诊断提供依据。本研究采用正辛酸-硫酸铵沉淀法纯化CA125包被和标记单克隆抗体,经透析后用紫外分光光度计测定280nm处吸光值,根据经验公式计算出两种抗体的蛋白浓度,再通过SDS-PAGE对两株抗体进行纯度鉴定。采用柠檬酸三钠还原法并控制柠檬酸三钠加入量的不同而制备不同粒径的胶体金,对其最适粒径、胶体金制备工艺、标记p H、最佳标记蛋白量、金标稀释液加入量、硝酸纤维素膜、样品垫处理液、划膜液和最佳包被抗体量等因素进行选择优化,并对试纸条的稳定性、特异性、灵敏度进行性能研究及实验室临床标本评价,制备出能快速检测人血清中CA125的胶体金检测试纸。实验结果表明,纯化后获得的抗体纯度较高,其中每3m L抗体腹水纯化后获得1m L CA125包被抗体,浓度为14.93mg/m L,1.15m L标记抗体,浓度为15.08mg/m L。采用的24.5nm胶体金颗粒相对均一,且性能稳定。胶体金制备的最优工艺为:加热至沸腾时间8min,200rpm最大转速,颜色稳定后继续加热5min。通过反应模式优化,建立了胶体金检测试纸条工艺:胶体金与蛋白标记p H为7.5,标记蛋白浓度为1.4mg/m L,金标稀释液加入量为300μL/m L,NC膜选用TEST NC膜,样品垫处理液最佳配方组合为0.03M p H8.8 Tris、0.3%Tween-20、0.5%pvp、0.3%柠檬酸,质控线和检测线包被蛋白浓度1.5mg/m L,以此方法建立的试纸条灵敏度为35U/m L,且不与CEA、AFP、CA50、CA15-3、CA19-9发生交叉反应,37℃加速破坏实验21d后显示该试纸条稳定性良好。临床评价结果显示:200份临床标本的检测阳性符合率100/100,阴性符合率98/100。本研究成功建立了CA125胶体金免疫层析双抗体夹心检测方法,该检测方法具有较高灵敏度、稳定性、特异性。
【关键词】：CA125 胶体金免疫层析 卵巢癌
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 引言8-10
• 符号与缩略语10-14
• 第一章 综述14-25
• 1.1 CA125概述14-16
• 1.1.1 CA125分子结构14
• 1.1.2 CA125生物表达特性14-15
• 1.1.3 CA125基因结构与功能15
• 1.1.4 CA125与卵巢癌的相关性15-16
• 1.2 CA125的检测方法及其研究进展16-17
• 1.2.1 放射免疫分析法16
• 1.2.2 酶联免疫法16
• 1.2.3 化学发光免疫分析16-17
• 1.2.4 免疫荧光分析法17
• 1.3 胶体金免疫层析快速检测技术17-22
• 1.3.1 胶体金免疫层析技术的研究背景17-18
• 1.3.2 胶体金结构特点及技术特性18-20
• 1.3.3 胶体金及胶体金标记20-21
• 1.3.4 胶体金免疫层析技术发展前景21-22
• 1.4 本研究目的意义及主要内容22-25
• 第二章 材料与方法25-46
• 2.1 实验材料25-32
• 2.1.1 主要试剂及材料25-27
• 2.1.2 主要仪器设备27
• 2.1.3 主要溶液配置27-32
• 2.2 实验方法32-46
• 2.2.1 CA125包被与标记抗体纯化及鉴定32-34
• 2.2.2 CA125胶体金免疫层析方法初步建立34-36
• 2.2.3 胶体金制备36-39
• 2.2.4 免疫金制备39-41
• 2.2.5 NC膜的选择41
• 2.2.6 抗体包被41-42
• 2.2.7 样品垫的处理42-44
• 2.2.8 CA125胶体免疫层析检测试纸制备工艺的确定44
• 2.2.9 试纸条灵敏度实验44-45
• 2.2.10 试纸条特异性实验45
• 2.2.11 试纸条稳定性实验45
• 2.2.12 临床标本检测45-46
• 第三章 实验结果46-64
• 3.1 正辛酸-硫酸铵法腹水纯化46
• 3.2 SDS-PAGE鉴定46-47
• 3.3 最适胶体金粒径选择结果47-48
• 3.4 胶体金制备工艺优化结果48-49
• 3.5 胶体金质量鉴定结果49-50
• 3.5.1 肉眼观察49-50
• 3.5.2 紫外-可见分光光度计扫描结果50
• 3.5.3 透射电镜观察结果50
• 3.6 免疫金制备50-54
• 3.6.1 最适标记p H51
• 3.6.2 最适标记蛋白量51-53
• 3.6.3 金标稀释液加入量优化结果53-54
• 3.7 NC膜的选择结果54-55
• 3.7.1 不同NC膜的显色结果比较54
• 3.7.2 不同湿度环境的显色比较结果54-55
• 3.8 抗体包被55-56
• 3.8.1 划膜液选择结果55
• 3.8.2 包被抗体浓度优化结果55-56
• 3.9 样品垫的处理56-59
• 3.9.1 样品垫处理与否对检测结果的影响56-57
• 3.9.2 样品垫处理液优化结果57-59
• 3.10 CA125胶体免疫层析检测试纸制备工艺的确定59-61
• 3.10.1 标记59
• 3.10.2 包被59-60
• 3.10.3 组条60
• 3.10.4 切条60
• 3.10.5 检测60-61
• 3.11 试纸条灵敏度确定61
• 3.12 试纸条特异性实验结果61-62
• 3.13 稳定性实验结果62-63
• 3.14 临床标本检测结果63-64
• 第四章 讨论64-67
• 4.1 CA125试纸条制备方法的选择64
• 4.2 胶体金制备工艺的确定64-65
• 4.3 最适标记p H的选定65
• 4.4 CA125试纸条样品垫处理液优化65-66
• 4.5 划膜液的优化66-67
• 第五章 结论与展望67-68
• 5.1 结论67
• 5.2 未来工作及前景展望67-68
• 参考文献68-74
• 致谢74-75
• 攻读学位期间发表的学术论文目录75-76

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 陈丹;孙广瑞;柳增善;;辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用[J];安徽农业科学;2007年26期

2 孔繁德,黄印尧,赖清金;免疫胶体金技术及其发展前景[J];福建畜牧兽医;2002年S1期

3 吕绳凯,刘煜凯;免疫胶体金的制备及应用[J];上海医学检验杂志;1990年01期

4 吴刚;姜瞻梅;霍贵成;田波;;胶体金免疫层析技术在食品检测中的应用[J];食品工业科技;2007年12期

5 朱梓华,朱涛,刘忠范;大粒径单分散金纳米粒子的水相合成[J];物理化学学报;1999年11期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 孙园园;胶体金免疫层析法联合检测EV71和CA16 IgM的研究[D];新乡医学院;2014年

，

本文编号：562244