基于信号放大技术在肿瘤细胞及其标志物中的研究

发布时间：2017-07-20 04:12

  本文关键词：基于信号放大技术在肿瘤细胞及其标志物中的研究

  更多相关文章： DNA循环放大 溶菌酶 microRNA 四螺旋结构分子探针 三螺旋结构分子探针

【摘要】：本文采用表面增强拉曼散射分析方法和荧光分析方法,设计纳米金生物条码用于SERS活性检测,构建了基于靶循环放大方法和聚合剪切引发的循环放大方法、基于三螺旋分子探针和滚环复制的循环放大方法、基于靶引发的发卡DNA循环放大方法,实现了对溶菌酶、mi RNA等肿瘤标志物的高灵敏、高特异性检测。主要内容包含以下几个方面:1.利用简单方法制备了一种新型的DNA四螺旋结构分子(FHJM)探针,它包含三个功能部分:适体-目标物识别区域,引发循环放大反应的触发区域,聚合-剪切放大反应的模板区域。四螺旋结构分子探针中的引发链DNA-1被设计成含有溶菌酶适配子的一段序列,用于靶的识别,并构成了四螺旋结构分子探针左侧两边手臂中的一支。用于聚合剪切的模板链DNA-2通过瓦特生-克里克碱基互补配对构成了四螺旋结构分子探针中的右边部分。它右侧的两个分支通过单链DNA-b连接从而构成了四螺旋结构分子探针右侧的环形部分,基于交叉碱基配对原理,触发链DNA-b构成了我们分支探针的四螺旋序列。当存在溶菌酶时,它可以与DNA-6链杂交。我们首次将这种探针引入到表面增强拉曼散射(SERS)检测技术中,成功发展了一种FHJM-SERS检测方法,实现了对溶菌酶的高灵敏度检测,检测限可以低至0.5 fM。结合了适体识别技术,FHJM-SERS的检测方法具有很好的特异性,如果把各种识别单元植入到这种FHJM探针中,将可能构建一种能够识别各种目标物的传感平台。另外,该方法为我们提供了一个高灵敏性的平台,这极大的拓展了我们的研究视野。2.基于核酸分子聚集体(NAMAs)在氧化石墨烯纳米片(graphene oxide,简称GO)上自组装和由靶识别区域及引发滚环放大反应的引物区域构成的三螺旋结构,我们研发了一种新型的,高灵敏的方法来检测miRNA和进行细胞内成像分析,这是首次将滚环放大反应引入细胞内进行。修饰有FAM荧光基团的单链DNA能够被氧化石墨烯纳米片猝灭,但当远离时,又会重新恢复荧光。值得注意的是,核酸分子自组装策略被成功的应用于低丰度靶miRNA的检测和细胞内成像分析。与传统的滚环放大反应比较,自组装的核酸分子聚集体能在细胞内聚集并在单个的癌细胞内产生明亮的荧光斑点,因此可以显著的区别癌细胞和正常细胞。基于核酸分子聚集体的细胞内靶miRNA成像技术对早期癌症检测起到了极大的促进作用,成为一种新型有效的可视化细胞检测技术。3.通过对介孔二氧化硅纳米粒子的氨基化修饰(PCMSNs),使其表面呈正电,利用正负电相互吸引,使得核酸分子聚集体在其表面发生自组装之后进入细胞,在此原理的基础上,首次设计了基于氨基修饰的介孔二氧化硅纳米粒子核酸分子聚集体(ONAAs)自组装,引发单细胞内杂交链式反应(HCR),实现对靶microRNA的检测。由此,我们构建了一种新型的ONAAs-PCMSNs策略用于单细胞内靶miRNAs的分析。整个策略的设计关键是核酸分子通过静电作用发生自组装,能够引发杂交链式反应,进而实现信号分子的聚集与放大。我们设计了两种发卡结构的探针DNA-N1和DNA-N2,其中DNA-N2分别修饰荧光分子ROX和猝灭分子BHQ。发卡探针DNA-N1和DNA-N2的环部区域可以灵活的在表面带有正电荷的PCMSNs上发生自组装;当探针N1和N2在PCMSNs表面自组装后,导入活细胞内进行孵育,在靶的诱导作用下使其表面的N1发生游离或者流动性增加。然后,大量的发卡N2链的茎部被打开。在该方法中,链式反应通过N1和N2的交替杂交而引发,形成N1和N2的聚集体。由于静电吸引作用,杂交链式反应产物在PCMSNs表面发生自组装,形成具有稳定的构象的核酸分子聚集体,进而产生相应的荧光信号的变化。和之前的氧化石墨烯纳米片作载体检测细胞内靶相比,放大效率显著提高。
【关键词】：DNA循环放大 溶菌酶 microRNA 四螺旋结构分子探针 三螺旋结构分子探针
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.43
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-14
• 第一章 前言14-32
• 1.1 MicroRNA简介15-16
• 1.1.1 MicroRNA概念及特点15
• 1.1.2 MicroRNA的发现过程15-16
• 1.2 MicroRNA与疾病16-17
• 1.2.1 肿瘤16
• 1.2.2 肿瘤标志物16
• 1.2.3 MicroRNA与癌症16-17
• 1.3 MicroRNA及端粒酶的检测17-18
• 1.3.1 Northern Blot及其改进17-18
• 1.3.2 Microarray及微球高通量检测法简介18
• 1.4 纳米材料18-20
• 1.4.1 基于纳米金技术的检测18-19
• 1.4.2 基于介孔二氧化硅的检测19
• 1.4.3 基于石墨烯的检测19-20
• 1.5 DNA循环放大技术20-21
• 1.5.1 滚环复制放大反应20-21
• 1.5.2 杂交链式反应21
• 1.6 表面增强拉曼散射21-23
• 1.6.1 拉曼散射21-22
• 1.6.2 表面增强拉曼散射技术22-23
• 1.6.2.1 SERS简介22
• 1.6.2.2 SERS在生物分析中的应用22-23
• 1.7 本工作的研究意义及内容23-24
• 参考文献24-32
• 第二章 基于四螺旋结构分子探针的循环放大体系用于溶菌酶的SERS高灵敏检测32-50
• 2.1 实验部分33-38
• 2.1.1 试剂33-35
• 2.1.2 仪器35
• 2.1.3 纳米金的合成35
• 2.1.4 DNA-3 及发卡DNA在磁珠上的固定35-36
• 2.1.5 表面增强拉曼信号探针的构建36
• 2.1.6 四螺旋结构分子探针-表面增强拉曼反应原理36-37
• 2.1.7 表面增强拉曼检测37-38
• 2.2 结果与讨论38-46
• 2.2.1 纳米金的电镜(Transmission Electron Microscope, 简称TEM)表征38
• 2.2.2 纳米金巯基复合物的紫外表征38-39
• 2.2.3 FHJM的构建及凝胶电泳成像39-40
• 2.2.4 方案的可行性验证40-41
• 2.2.5 对照实验41
• 2.2.6 对溶菌酶的定量实验41-43
• 2.2.7 特异性实验43-44
• 2.2.8 实验条件的优化44-46
• 2.2.8.1 温度和pH对反应的影响44-45
• 2.2.8.2 KF聚合酶和核酸内切酶量的影响45-46
• 2.2.8.3 孵育时间的优化46
• 2.3 实验小结46-47
• 参考文献47-50
• 第三章 基于三螺旋结构探针和自组装核酸分子聚集体的活细胞内miRNA的可视化检测50-69
• 3.1 实验部分51-55
• 3.1.1 材料与试剂51-53
• 3.1.2 仪器53
• 3.1.3 三螺旋结构分子及环链DNA在纳米磁珠表面的固定53-54
• 3.1.4 羧基修饰纳米磁珠的制备54
• 3.1.5 氧化石墨烯纳米片的制备54-55
• 3.1.6 细胞的培养及miRNA的提取55
• 3.2 结果与讨论55-65
• 3.2.1 miRNA的可视化检测原理55-56
• 3.2.2 GO与DHS的纳米组装56-57
• 3.2.3 合成的纳米磁珠的电镜图57-58
• 3.2.4 三螺旋分子结构的荧光及电泳表征58-59
• 3.2.5 氧化石墨烯纳米片(GONPs)对不同类型核酸分子的选择性吸附59-61
• 3.2.6 实验条件的优化61-63
• 3.2.6.1 Phi 29聚合酶的用量及反应时间的优化61-62
• 3.2.6.2 三螺旋结构分子-纳米磁珠复合物及氧化石墨烯纳米片纳米片对细胞的毒性实验62-63
• 3.2.7 特异性分析63-64
• 3.2.8 miRNAs检测的灵敏度实验64-65
• 3.2.9 细胞实验65
• 3.3 小结65-66
• 参考文献66-69
• 第四章 基于静电吸附的有序核酸分子聚集体对单细胞内miRNA的可视化检测69-88
• 4.1 实验部分70-74
• 4.1.1 试剂70-72
• 4.1.2 仪器72-73
• 4.1.3 氨基修饰二氧化硅(PCMSNs)的合成73
• 4.1.4 PCMSNs-N1N2探针的制备73
• 4.1.5 ONAAs-PCMSNs的构建73-74
• 4.2 结果与讨论74-84
• 4.2.1 单细胞靶miRNA检测的ONAAs-PCMSNs策略构建原理74-75
• 4.2.2 可行性实验75-76
• 4.2.3 PCMSNs的TEM76-77
• 4.2.4 PCMSNs的氮吸附77-78
• 4.2.5 HCR实验条件的优化78-79
• 4.2.5.1 杂交链式反应时间的优化78
• 4.2.5.2 缓冲液的pH值78
• 4.2.5.3 反应温度的优化78-79
• 4.2.6 ONAAs-PCMSNs策略检测miRNA的灵敏度79-81
• 4.2.7 细胞的培养及miRNA的提取81
• 4.2.8 N1和N2自组装的氨基介孔二氧化硅的MTT实验81-82
• 4.2.9 特异性试验82-83
• 4.2.10 细胞成像83-84
• 4.3 小结84-85
• 参考文献85-88
• 攻读硕士期间发表的论文88-89
• 致谢89

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本文编号：566195