PRMT5促进肝癌细胞上皮—间质转化的作用及其机制研究

发布时间：2017-07-20 11:09

  本文关键词：PRMT5促进肝癌细胞上皮—间质转化的作用及其机制研究

  更多相关文章： 蛋白质精氨酸甲基化转移酶5(PRMT5) 上皮间质转化(EMT) SNAIL 肝癌 增殖 迁移 侵袭

【摘要】：研究目的:本研究旨在探讨蛋白质精氨酸甲基化转移酶5(protein arginine methyltranserase 5,PRMT5)对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响,并初步阐明其促进上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)作用的分子机制,为进一步的临床应用研究提供理论基础。研究方法:Western Blot、qPCR检测不同肝癌细胞中PRMT5蛋白质及mRNA的表达水平;利用慢病毒介导的RNAi技术,构建PRMT5 shRNA干扰质粒sh-PRMT5,并进行慢病毒包装,感染肝癌细胞,嘌呤霉素筛选得到能稳定低表达PRMT5的肝癌细胞株,Western Blot、qPCR检测干扰效率。将PRMT5过表达质粒pHA-PRMT5瞬时转染稳转细胞株以恢复其PRMT5的表达。用CCK-8法检测PRMT5对肝癌细胞增殖能力的影响,平板克隆形成实验检测PRMT5对肝癌细胞克隆形成能力的影响,Transwell迁移实验检测PRMT5对肝癌细胞迁移能力的影响,Transwell侵袭实验检测PRMT5对肝癌细胞侵袭能力的影响,来评价PRMT5对肝癌细胞生物学行为的影响。Western blot检测PRMT5对侵袭相关指标MMP2和MMP9蛋白表达量的影响,及上皮间质转化相关指标E-cadherin、Collagen-I、β-catenin、α-SMA、Vimentin和SNAIL的蛋白水平的变化,免疫荧光及蛋白质核浆分离实验检测肝癌细胞中SNAIL亚细胞定位的变化,初步探明PRMT5促进EMT的分子机制。研究结果:结果表明:PRMT5特异性shRNA慢病毒载体构建成功。肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402中PRMT5表达量相对较高。PRMT5特异性shRNA慢病毒载体构建成功。慢病毒包装并感染SMMC-7721、BEL-7402细胞株,Western blot、q PCR检测结果表明PRMT5 shRNA慢病毒载体sh-PRMT5在肝癌细胞中具有沉默效率。靶向沉默PRMT5的表达后,肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力减弱,MMP2和MMP9的蛋白表达水平下降,E-cadherin和SNAIL蛋白表达水平增加,Collagen-I、β-catenin、α-SMA和Vimetin蛋白表达水平下降;过表达PRMT5可以部分增强肝癌细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力、侵袭能力,提高MMP2和MMP9的蛋白表达水平和Collagen-I、β-catenin、α-SMA、Vimetin和SNAIL蛋白表达水平,降低E-cadherin蛋白表达水平。免疫荧光及蛋白质核浆分离实验结果表明,靶向沉默PRMT5的表达后,肝癌细胞中SNAIL由细胞核穿梭至细胞质中,而恢复稳转细胞中PRMT5的表达后,SNAIL又重新回到细胞核中。研究结论:PRMT5促进了肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭等生物学行为;其通过调控SNAIL的亚细胞定位促进了肝癌细胞的上皮间质转化。
【关键词】：蛋白质精氨酸甲基化转移酶5(PRMT5) 上皮间质转化(EMT) SNAIL 肝癌 增殖 迁移 侵袭
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 主要缩略词表11-13
• 第一章 绪论13-19
• 1.1 研究背景13-17
• 1.1.1 肝癌13
• 1.1.2 蛋白质精氨酸甲基转移酶 513-15
• 1.1.3 上皮间质转化15-16
• 1.1.4 SNAIL16-17
• 1.2 本研究的目的、内容、方法与技术路线17-19
• 1.2.1 研究目的17
• 1.2.2 研究内容17-18
• 1.2.3 研究技术路线图18
• 1.2.4 研究意义18-19
• 第二章 载体构建与鉴定、慢病毒包装、稳转细胞株筛选19-41
• 2.1 实验仪器和材料19-23
• 2.1.1 实验仪器19-20
• 2.1.2 实验耗材20
• 2.1.3 实验试剂20-21
• 2.1.4 试剂配制21-23
• 2.2 实验方法23-36
• 2.2.1 细胞培养23-25
• 2.2.2 DH5α/ Stbl3感受态细胞制备方法25-26
• 2.2.3 重组慢病毒sh-GFP及sh-PRMT5载体构建26-30
• 2.2.4 包装病毒30-31
• 2.2.5 感染细胞31
• 2.2.6 总RNA提取31-32
• 2.2.7 qPCR检测方法32-33
• 2.2.8 Western Blot检测方法33-36
• 2.3 数据处理与统计方法36
• 2.4 结果36-39
• 2.4.1 检测三种不同肝癌细胞系中PRMT5的表达36
• 2.4.2 pLKO.1-TRC质粒双酶切36-37
• 2.4.3 菌液PCR鉴定重组质粒sh-PRMT537
• 2.4.4 sh-PRMT5质粒测序结果37-38
• 2.4.5 检测sh- PRMT5干扰效率38-39
• 2.5 讨论39-41
• 第三章 PRMT5对肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭的影响41-51
• 3.1 实验仪器和材料41-42
• 3.1.1 实验仪器41
• 3.1.2 实验耗材41
• 3.1.3 实验试剂41-42
• 3.1.4 试剂配制42
• 3.2 实验方法42-44
• 3.2.1 质粒转染42
• 3.2.2 CCK-8 实验42-43
• 3.2.3 平板克隆形成实验43
• 3.2.4 Transwell迁移实验43
• 3.2.5 Transwell侵袭实验43-44
• 3.2.6 细胞培养、Western blot44
• 3.3 数据处理与统计方法44
• 3.4 结果44-49
• 3.4.1 CCK-8 法检测PRMT5对肝癌细胞增殖能力的影响44-45
• 3.4.2 平板克隆形成实验检测PRMT5对肝癌细胞克隆形成能力的影响45-46
• 3.4.3 Transwell迁移实验检测PRMT5对肝癌细胞迁移能力的影响46-47
• 3.4.4 Transwell侵袭实验检测PRMT5对肝癌细胞侵袭能力的影响47-48
• 3.4.5 Western Blot检测PRMT5对侵袭相关蛋白表达的影响48-49
• 3.5 讨论49-51
• 第四章 PRMT5对肝癌细胞EMT的影响及其分子机制51-61
• 4.1 实验仪器和材料52-53
• 4.1.1 实验仪器52
• 4.1.2 实验耗材52
• 4.1.3 实验试剂52-53
• 4.1.4 试剂配制53
• 4.2 实验方法53-54
• 4.2.1 免疫荧光53
• 4.2.2 细胞核与细胞浆蛋白分离提取53-54
• 4.2.3 质粒转染、细胞培养、Western blot54
• 4.3 数据处理与统计方法54
• 4.4 结果54-58
• 4.4.1 Western Blot检测PRMT5对EMT相关蛋白的影响54-56
• 4.4.2 免疫荧光检测PRMT5对SNAIL亚细胞定位的影响56-58
• 4.5 讨论58-61
• 结论与展望61-63
• 参考文献63-70
• 综述70-77
• 参考文献73-77
• 攻读硕士期间发表论文77-78
• 致谢78

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本文编号：567697