癌基因Ras及其常见突变与p53协同作用对结肠癌细胞化疗药物敏感性的研究

发布时间：2017-07-26 06:16

  本文关键词：癌基因Ras及其常见突变与p53协同作用对结肠癌细胞化疗药物敏感性的研究

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【摘要】：目的Ras是一种原癌基因,其突变广泛存在于多种肿瘤细胞中,在结直肠癌中突变率可达30%以上,与结直肠癌发生、发展以及靶向治疗疗效预测等均有密切关系。突变后的Ras结构发生改变引起下游多条信号通路激活,并且与肿瘤的侵袭和转移密切相关。p53基因是发现最早的一种肿瘤抑制基因,参与细胞周期、凋亡、衰老、维持基因组稳定性、修复损伤DNA。近年来,p53作为基因治疗的靶标已初步应用于临床,通过对p53基因表达水平的提升以及p53正常功能的修复参与肿瘤的治疗。研究发现,在肿瘤发生过程中p53与Ras介导的通路之间存在着复杂的相互协同作用关系。因此,在Ras高水平突变的结直肠癌药物治疗过程中,p53与Ras基因的突变之间存在着怎样的相互作用关系需要通过体内、体外的科学实验进行深入的研究。本课题旨在利用体外结肠癌细胞模型,探讨p53与Ras及常见突变协同作用对结肠癌细胞奥沙利铂药物敏感性的影响。为在Ras高突变率的情况下,研究提高化疗药物疗效以及开发新的辅助治疗手段提供可靠的实验依据。方法第一部分:收集67对结直肠癌患者癌组织和癌旁组织,提取m RNA,RT-PCR扩增K-Ras和p53序列,检测K-Ras和p53突变情况;应用卡方检验分析癌组织和癌旁组织突变的差异,应用秩相关性分析K-Ras突变与p53突变的关系。第二部分:体外培养HCT116 p53-/-细胞系,分6组:(1)Ras单转染组;(2)Ras V12单转染组;(3)Ras N17单转染组;(4)Ras+Ad-p53组;(5)Ras V12+Ad-p53组;(6)Ras N17+Ad-p53组;培养HCT116 p53-/-细胞系密度达60%后,经过质粒转染及病毒感染24小时,奥沙利铂处理12小时。利用Calcein/PI荧光原位分析不同处理对细胞凋亡水平的影响;应用MTT法检测奥沙利铂作用下细胞存活率;提取细胞总RNA,逆转录后实时定量PCR分析凋亡相关基因Bax和Bcl-2的m RNA转录水平;提取细胞总蛋白,通过WB法检测奥沙利铂作用下各组中Bax、Bcl-2、p53和Ras等基因相关蛋白表达情况。结果1.收集67对结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织,提取m RNA,逆转录后扩增K-Ras和p53基因,测序检测突变情况发现:K-Ras第12个氨基酸突变率最高,在癌组织中达到25.37%(17/67),癌旁组织中突变显著低于癌组织为14.9%(10/67)(p0.01);第13个氨基酸突变率也较高,癌组织和癌旁组织中分别为10.45%(7/67)和2.99%(2/67)(p0.01);第17个氨基酸突变率最低,仅有1个患者癌组织和癌旁组织发生第17位氨基酸的突变(p0.05);p53基因的236位点突变率在癌组织中为10.45%(7/67),癌旁组织中为5.97%(4/67)(p0.05);249位点突变率在癌组织中为20.9%(14/67),癌旁组织中为11.94%(8/67)(p0.05);应用秩相关性分析K-Ras突变与p53突变之间无显著相关性。2.通过Calcein-AM/PI染色我们发现,当p53缺失时,Ras单转染组、Ras V12单转染组、Ras N17单转染组的凋亡率分别为(8.3±1.5)%、(16.8±1.7)%、(4.4±1.6)%,其中Ras V12单转染组凋亡率明显高于其他两组,这提示我们在L-OHP药物作用下,Ras V12突变显著提高了细胞凋亡率;当p53高表达时,Ras+Ad-p53、Ras V12+Ad-p53、Ras N17+Ad-p53凋亡率分别为(13.5±1.9)%、(25.9±2.2)%、(7.6±1.2)%,Ras V12+Ad-p53组凋亡率最高,而对比于p53缺失的三组,p53高表达的三组凋亡率明显增高,这说明L-OHP药物作用下Ras与p53具有协同增强细胞的凋亡的作用。3.为了证实Calcein-AM/PI染色结果,我们又应用了MTT法检测奥沙利铂作用下各种细胞的存活数量,结果发现,Ras N17转染组、Ras转染组、Ras V12转染组、Ras N17+p53组、Ras+p53组、Ras V12+p53组六组的平均OD值分别为0.875、0.769、0.647、0.482、0.316、0.247,细胞相对存活率分别为93.3%,82.0%,69.0%,51.4%,33.7%,26.3%。4.随后我们通过免疫印记结果来进一步证实,Ras+Ad-p53、Ras V12+Ad-p53、Ras N17+Ad-p53三组的凋亡蛋白Bax表达水平均高于Ras单转染组、Ras V12单转染组、Ras N17单转染组,验证了Ras与p53具有协同增强细胞凋亡的作用,Bcl-2的表达水平则与Bax结果相反;而在Ras+Ad-p53、Ras V12+Ad-p53、Ras N17+Ad-p53三组中,Ras V12+Ad-p53组的Bax表达水平最高,Ras+Ad-p53组次之,Ras N17+Ad-p53最低,Bcl-2的表达水平则与Bax结果相反。5.最后,我们通过实时荧光定量PCR来表明,p53高表达与缺失条件下,Ras V12转染组Bax m RNA表达水平均显著高于Ras转染组和Ras N17转染组,且p53高表达时较p53缺失时表达水平明显增高。结论1.在结直肠癌患者中,癌组织中K-Ras和p53基因突变率高于癌旁组织,进一步证实了这两个基因的突变与肿瘤的发生密切相关;2.在化疗药物奥沙利铂作用下,不同Ras突变体的过表达能够引起细胞凋亡水平的改变;3.p53与Ras具有协同作用,过表达p53能够提高Ras的促细胞凋亡作用,提高细胞对药物的敏感性。
【关键词】：结直肠癌 K-Ras p53基因 凋亡
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 主要符号表11-13
• 第一章 前言13-21
• 第二章 材料与方法21-29
• 2.1 实验试剂及器材21-24
• 2.2 实验方法24-29
• 第三章 结果29-33
• 3.1 第一部分29
• 3.2 第二部分29-33
• 第四章 讨论33-41
• 第五章 结论41-43
• 参考文献43-51
• 附录51-57
• 攻读硕士期间参与发表文章及获奖情况57-58
• 致谢58

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本文编号：575046