microRNA98靶向N-RAS调控涎腺腺样囊性癌恶性生物学行为的研究

发布时间：2017-07-27 18:00

  本文关键词：microRNA98靶向N-RAS调控涎腺腺样囊性癌恶性生物学行为的研究

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【摘要】：目的探讨miR-98在涎腺腺样囊性癌组织和癌旁组织、高/低转移细胞系中的表达差异及其对腺样囊性癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响,通过生物信息学软件寻找mi R-98的潜在靶基因并初步探讨miR-98参与调控涎腺腺样囊性癌的作用机理。方法1、miR-98在涎腺腺样囊性癌中的表达及其对涎腺腺样囊性癌细胞恶性生物学行为的影响:通过real-time PCR检测3例新鲜涎腺腺样囊性癌组织以及癌旁正常组织、高转移细胞系ACC-M以及低转移细胞系SACC-83中miR-98的表达水平。采用lipofectamine2000介导转染mi R-98mimics使miR-98过表达,并通过RT-PCR验证。通过MTT实验检测细胞增殖能力的变化,流式细胞术检测细胞周期的变化,划痕实验、趋化运动实验检测迁移能力变化,Transwell检测侵袭能力变化,Western blotting检测迁移相关蛋白的表达变化。2、miR-98靶向N-RAS通过RAS信号通路调控涎腺腺样囊性癌的作用机理:采用生物信息学软件TargetScan、PicTar、miRbase等对miR-98潜在的靶基因结合位点进行分析,发现N-RAS基因mRNA的3,非翻译区中多个软件预测的共同结合位点区域。构建包含结合位点的野生型荧光素酶报告基因载体WT-NRAS-PGL3-control及突变型的荧光素酶报告基因载体MUT-NRAS-PGL3-control。双荧光素酶报告基因实验验证N-RAS是mi R-98的靶基因。miR-98mimics转染细胞调高mi R-98的表达水平后,Western blotting以及免疫荧光技术检测N-RAS的表达变化,Western blotting检测N-RAS蛋白的表达变化以及下游MAPK/ERK信号通路中ERK、p-ERK和PI3K/AKT信号通路中AKT、p-AKT的表达变化。收集我院涎腺腺样囊性癌石蜡标本43例及临床病理资料,免疫组织化学检测涎腺腺样囊性癌石蜡标本中N-RAS的表达情况,并与临床病理因素行相关性分析。结果1、miR-98在涎腺腺样囊性癌组织和高转移细胞系中的表达水平显著低于癌旁正常组织和低转移细胞系SACC-83,差异具有统计学意义。以ACC-M作为细胞模型,转染miR-98 mimics调高miR-98的表达水平;MTT结果显示miR-98过表达后,细胞的增殖能力受到抑制;平板克隆实验结果显示细胞的克隆形成率下降;流式细胞术提示S期的细胞明显减少,而G0/G1期的细胞明显增多,表明细胞被阻滞在G0/G1期向S期的转化进程中;划痕闭合延迟、趋化实验穿膜细胞数减少,细胞的迁移能力下降;Transwell小室穿过基质的细胞数减少,细胞的侵袭能力下降;Western blotting检测迁移相关蛋白,E-cadherin的表达上调,N-cadherin、Vimentin的表达下调。2、生物信息学软件TargetScan、PicTar、miRbase分析结果显示N-RAS是miR-98的靶基因之一,3个靶基因数据库的预测结果显示的其结合位点均含有位于N-RAS基因3,端的186-192的碱基序列。miR-98 mimics转染后48h,RT-PCR验证miR-98在转染组中的表达水平上调;Western blotting结果显示miR-98过表达后N-RAS蛋白的表达水平下降;免疫荧光结果显示N-RAS的表达定位于细胞浆,miR-98过表达后胞浆的荧光信号减弱。双荧光素酶报告基因检测发现miR-98能够显著抑制野生型报告基因载体WT-NRAS-PGL3-control的荧光素酶活性,而对突变型报告基因载体MUT-NRAS-PGL3-control的荧光素酶活性没有影响。miR-98 mimics转染后48h,提取总蛋白,Western blotting结果显示miR-98过表达后MAPK/ERK信号通路中ERK蛋白的表达水平不变,而p-ERK蛋白的表达水平下调;PI3K/AKT信号通路中AKT蛋白的表达水平不变,而p-AKT蛋白的表达水平下调。N-RAS在涎腺腺样囊性癌组织中主要在胞浆中呈阳性表达,其阳性表达率为83.7%(36/43),N-RAS的表达水平与临床分期、肿瘤大小相关(P0.05),而与性别、年龄、组织分型、颈淋巴结转移无关。结论1、miR-98在涎腺腺样囊性癌中呈低表达状态。miR-98通过阻滞细胞周期中G0/G1期向S期的转化进程,抑制涎腺腺样囊性癌细胞的增殖能力,并且抑制ACC-M细胞的迁移和侵袭能力。2、N-RAS是mi R-98的靶基因,其过表达与涎腺腺样囊性癌的临床分期及肿瘤大小相关。miR-98通过调控N-RAS下游的MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路影响腺样囊性癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力。
【关键词】：涎腺腺样囊性癌 miR-98 N-RAS 迁移 侵袭
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.87
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-15
• 研究现状、成果11-13
• 研究目的、方法13-15
• 一、miR-98调控涎腺腺样囊性癌的恶性生物学行为15-34
• 1.1 对象和方法15-26
• 1.1.1 实验材料15-18
• 1.1.2 实验方法18-26
• 1.1.3 统计学处理26
• 1.2 结果26-31
• 1.2.1 miR-98在涎腺腺样囊性癌中的表达26-27
• 1.2.2 实时定量PCR检测miR-98 mimics在ACC-M中的转染效果27
• 1.2.3 MTT法检测miR-98 mimics转染后细胞增殖能力的变化27
• 1.2.4 平板克隆法检测miR-98 mimics转染后细胞克隆形成能力的变化27-28
• 1.2.5 流式细胞术检测miR-98 mimics转染后细胞周期的变化28-29
• 1.2.6 划痕实验检测miR-98 mimics转染后细胞迁移能力的变化29
• 1.2.7 趋化实验检测miR-98 mimics转染后细胞运动能力的变化29-30
• 1.2.8 Transwell检测miR-98 mimics转染后细胞侵袭能力的变化30
• 1.2.9 miR-98 mimics转染后迁移相关蛋白的表达变化30-31
• 1.3 讨论31-33
• 1.4 小结33-34
• 二、miR-98靶向N-RAS通过RAS信号通路调控涎腺腺样囊性癌的机制探讨34-51
• 2.1 对象和方法34-42
• 2.1.1 实验对象及材料34-35
• 2.1.2 实验方法35-42
• 2.1.3 统计学处理42
• 2.2 结果42-47
• 2.2.1 N-RAS在涎腺腺样囊性癌细胞及组织中的表达42
• 2.2.2 miR-98负性调控靶基因N-RAS的表达42-43
• 2.2.3 成功构建荧光素酶基因报告载体43-45
• 2.2.4 双荧光素酶报告验证miR-98与N-RAS的直接调控关系45
• 2.2.5 miR-98过表达后ERK/p-ERK,AKT/p-AKT的表达变化45-46
• 2.2.6 N-RAS在涎腺腺样囊性癌石蜡组织中的表达46-47
• 2.2.7 N-RAS在涎腺腺样囊性癌中表达的临床意义47
• 2.3 讨论47-50
• 2.4 小结50-51
• 结论51-52
• 参考文献52-58
• 发表论文和参加科研情况说明58-59
• 综述 涎腺腺样囊性癌侵袭转移相关因子的研究进展59-68
• 综述参考文献64-68
• 致谢68-70
• 个人简历70

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本文编号：582645