索拉非尼诱导肿瘤相关巨噬细胞促肝癌增殖、转移的机制研究

发布时间：2017-07-31 00:14

  本文关键词：索拉非尼诱导肿瘤相关巨噬细胞促肝癌增殖、转移的机制研究

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【摘要】：目的索拉非尼(Sorafenib),作为小分子多靶点蛋白激酶抑制剂,是目前唯一被FDA批准用于治疗晚期肝癌的靶向药物,尽管其在SHARP和ORIENTAL两项三期临床试验中已显示较好的抗癌活性,然而仅延长不足3个月的生存期,且对部分患者有效,提示肝癌患者存在着不同程度对Sorafenib的初级或获得性抵抗。另一方面,研究发现治疗过程中所导致的机体持续免疫反应是促进肿瘤发生发展的原因之一。近些年的研究逐渐开始关注分子靶向药物治疗肿瘤过程中的负面作用,包括通过影响肿瘤及其免疫微环境,直接和间接地促肿瘤的侵袭转移。之前,已有相关研究探索了Sorafenib与免疫微环境的关系。此外,我们课题组张伟的前期研究发现,Sorafenib治疗肝癌的过程中,尽管其抑制了原位肿瘤的增长,但sorafenib动员更多单核-巨噬细胞入血和浸润肿瘤组织促进肝癌的侵袭转移,以及通过炎性信号通路STAT3下调抑癌基因HTATIP2的表达,进一步增加肿瘤生长、肿瘤新生血管及肺转移灶的数量。因此,Sorafenib的确可作用于机体免疫功能从而影响其疗效,但考虑炎性微环境的极其复杂,Sorafenib治疗过程中是如何改变肿瘤微环境的机制需要进一步探讨。鉴于肿瘤转移是其本身及其与所处免疫微环境复杂相互作用的结果,因此,本文通过分析实验室数据,从Sorafenib治疗过程中肿瘤相关巨噬细胞(Tumor Associated Macrophages,TAMs)所起的作用方面进行研究,并探索进一步提高Sorafenib疗效的途径。方法1.应用不同剂量Sorafenib(1-10μmol/L)作用小鼠巨噬细胞(RAW264.7),采用MTT技术观察其对RAW264.7细胞增殖的影响。2.诱导RAW264.7分化为经典途径激活型巨噬细胞-M1型及选择途径激活型巨噬细胞-M2型,采用RT-PCR技术在转录水平检测两种巨噬细胞高表达因子的水平。3.Sorafenib作用RAW264.7细胞,应用RT-PCR、Elisa技术检测巨噬细胞表型及其分泌细胞因子的变化。4.应用MTT、划痕试验、Transwell试验检测低剂量Sorafenib作用后RAW264.7及其分泌的细胞因对低度恶性人肝癌MHCC-97L细胞系增殖、迁移及侵袭能力的影响。5.应用RT-PCR、Western bloting技术检测sorafenib对RAW264.7细胞中相关通路的激活情况。采用相关通路抑制剂,检测巨噬细胞极化状态的改变,进一步明确sorafenib调控RAW264.7细胞分化的分子机制。结果1.采用MTT实验检测不同浓度sorafenib对巨噬细胞增殖的影响。结果显示:与大剂量相比,低剂量sorafenib不抑制巨噬细胞的增殖。2.应用LPS诱导巨噬细胞呈现为M1型极化状态;IL-4诱导的巨噬细胞呈现为M2型极化状态,应用RT-PCR技术检测不同极化状态的巨噬细胞相关炎性因子在转录水平的表达差异,结果显示:M1型巨噬细胞高表达炎性因子IL-12、TNF-α,低表达IL-10、Arg1,M2型巨噬细胞高表达IL-10、Arg1,低表达IL-12、TNF-α,而两种极化状态下转录水平的IL-6表达量差异较小,提示两种巨噬细胞的极化状态在体内免疫微环境中所起的作用不同。3.分别采用RT-PCR、Elisa技术从m RNA、蛋白水平检测sorafenib处理后巨噬细胞高表达因子的变化情况从而反应巨噬细胞的极化状态,结果显示:sorafenib可以促使巨噬细胞高表达IL-10、IL-6,低表达IL-12并促进其向M2型活化。4.与sorafenib作用后的巨噬细胞共培养或上清夜培养,低度恶性肝癌细胞MHCC-97L的增殖、迁移及侵袭能力显著增强。5.采用RT-PCR、Western Blot技术证实:sorafenib通过激活巨噬细胞内NF-k B信号通路诱导其向M2型分化,其中NF-k B亚型P50起重要作用。6.给予NFk B通路特异性抑制剂后再次检测巨噬细胞极化状态发现:巨噬细胞恢复经典极化状态。提示NFk B通路的特异性抑制剂可以逆转sorafenib诱导的TAMs,其与sorafenib联合使用可能能提高sorafenib治疗效果。结论1.低剂量Sorafenib不抑制巨噬细胞增值。2.M1、M2巨噬细胞表达的炎性细胞因子存在差异。3.低剂量Sorafenib诱导巨噬细胞向M2型分化,并促进其分泌促瘤相关炎性因子。4.Sorafenib作用后巨噬细胞增强了人肝癌细胞系MHCC-97L的增值、转移、侵袭能力。5.Sorafenib通过激活NF-k B通路诱导巨噬细胞向M2型极化;通路的特异性抑制剂可以逆转sorafenib诱导的TAMs。
【关键词】：索拉非尼 肝细胞肝癌 巨噬细胞 NF-kB
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 缩略语/符号说明12-14
• 前言14-18
• 研究现状、成果14-17
• 研究目的、方法17-18
• 一、Sorafenib对巨噬细胞极化状态的影响18-44
• 1.对象和方法18-38
• 1.1 实验材料18-21
• 1.2 实验方法21-36
• 1.3 细胞实验36-38
• 2.实验结果38-41
• 2.1 低剂量sorafenib对小鼠巨噬细胞RAW264.7 的增殖影响较小38-39
• 2.2 M1型、M2巨噬细胞炎性相关因子表达水平存在差异39-40
• 2.3 Sorafenib诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7 向M2型分化40-41
• 3. 讨论41-43
• 4. 小结43-44
• 二、Sorafenib处理后巨噬细胞对肝癌细胞生物学功能的影响44-51
• 1.对象和方法44-46
• 1.1 细胞实验44-46
• 2.实验结果46-49
• 2.1 低剂量sorafenib处理后巨噬细胞能够增强肝癌细胞的迁移能力46-47
• 2.2 低剂量sorafenib处理后巨噬细胞能够增强肝癌细胞的侵袭能力47-48
• 2.3 低剂量sorafenib处理后巨噬细胞能够增强肝癌细胞的增殖能力48-49
• 3.讨论49-50
• 4.小结50-51
• 三、Sorafenib通过激活NF-kB信号通路诱导M2型巨噬细胞分化51-57
• 1.对象和方法51-52
• 1.1 细胞实验51-52
• 2.实验结果52-55
• 2.1 Sorafenib不激活巨噬细胞中STAT3相关通路52-53
• 2.2 Sorafenib激活NF-kB通路促进M2型巨噬细胞活化53
• 2.3 NF-kB通路抑制剂可恢复巨噬细胞M1型活化状态53-55
• 3.讨论55-56
• 4.小结56-57
• 结论57-58
• 参考文献58-64
• 发表论文和参加科研情况说明64-65
• 综述 抗血管生成剂在肝癌中耐药的研究进展65-75
• 综述参考文献69-75
• 致谢75

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本文编号：596654