Snail2和G9a在肝细胞EMT过程中的作用及机制研究

发布时间：2017-07-31 06:10

  本文关键词：Snail2和G9a在肝细胞EMT过程中的作用及机制研究

  更多相关文章： 肝细胞 EMT E-钙黏蛋白 Snail2 G9a

【摘要】：肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,居恶性肿瘤的第五位。手术切除和肝脏移植是目前临床上治疗肝癌的主要方法,但是由于肝癌细胞极易侵袭包膜和血管,导致肝内和肝外转移,使得患者的五年生存期仍低于10%。尸检发现,肝癌患者肝外转移率达到40%-71.6%,是导致患者死亡的主要原因。因此阐明恶性肿瘤的转移机制对于提高肝癌患者的生存期无疑具有极其重要的意义。肿瘤转移是一个极其复杂的病理学过程,肿瘤细胞的侵袭是肿瘤转移的前提,而上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是恶性肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的关键,因此阐明调控EMT过程的分子机制已成为肿瘤转移机制研究的关键。上皮细胞表面标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达下调是EMT过程的标志事件,同时伴随着N-钙粘蛋白(N-cadherin)、纤连蛋白(Fibronectin)和波形蛋白(Vimentin)等特定间质细胞表面标志蛋白的高表达。特定转录因子可以通过下调E-钙粘蛋白的表达诱导肿瘤细胞的EMT过程,从而促进肿瘤侵袭转移。Snail是肝癌侵袭转移过程中诱导EMT过程的关键作用因子之一,然而,在肝癌细胞的EMT过程中,Snail是通过何种机制抑制E-钙粘蛋白转录的仍不清楚。另外,表观遗传学信息的改变也是调控恶性肿瘤细胞发生EMT过程的重要机制,各种参与EMT过程的转录抑制因子可以利用不同的表观遗传机制实现对E-钙粘蛋白的表达调控。本课题前期研究表明,肝癌的发生发展与组蛋白甲基转移酶G9a的异常高表达密切相关,同时在乳腺癌细胞中,Snail家族蛋白通过与G9a相互作用共同介导E-钙粘蛋白的表达抑制,从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。然而,Snail和G9a在肝癌的侵袭转移过程中的作用尚未阐明。因此我们推测在肝癌侵袭转移过程中,Snail通过募集G9a抑制E-钙粘蛋白的转录,从而促进肝癌细胞发生EMT过程。我们首先利用TGF-β诱导人源肝细胞QSG-7701和HL-7702发生EMT现象。RT-PCR实验表明在肝细胞发生EMT过程中,E-钙粘蛋白在mRNA表达水平显著下降,N-钙粘蛋白、纤连蛋白和波形蛋在mRNA表达水平都明显增加。同时转录抑制因子Snail家族的Snail2在mRNA水平也高表达,而Snail1基因在mRNA水平并未上调。另外,在33对临床肝癌组织样品的检测中也发现,相比于癌旁组织,Snail2基因在肝癌组织中有高表达的趋势。接下来,我们进一步验证Snail2是否通过与G9a蛋白相互作用共同抑制E-钙粘蛋白的表达。首先分别构建了Snail2的全长及N端截短体600bp和C端截短体200bp的质粒,以及G9a的全长和N端截短体2039bp和C端截短体1832bp的质粒。通过免疫共沉淀实验证实,Snail2与G9a在体内能够结合,并且通过截短体的相互作用实验证明Snail2和G9a的C端有相互作用,与N端并无相互作用,并且Snail2的N端和G9a的C端也没有结合,说明二者的作用位点都在C端。同时染色质免疫共沉淀实验也表明,在发生了EMT过程的肝细胞中,Snail2和G9a均在E-钙粘蛋白基因上有一定富集,且E-钙粘蛋白基因上有H3K9me2修饰的发生,说明Snail2能够与G9a共同结合至E-钙粘蛋白基因上从而抑制其表达。综上所述,本论文初步确认,Snail2通过与G9a相互作用,将之募集到E-钙粘蛋白的基因上,使E-钙粘蛋白基因发生甲基化修饰,进而导致E-钙粘蛋白的表达受到抑制,从而诱发了EMT现象的发生。
【关键词】：肝细胞 EMT E-钙黏蛋白 Snail2 G9a
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第一章 前言11-20
• 1.1 肝癌的发生及其侵袭转移11-13
• 1.1.1 肝癌的发生11
• 1.1.2 肝癌的侵袭转移11-13
• 1.2 EMT及其调控机制13-14
• 1.2.1 EMT与肿瘤13
• 1.2.2 EMT的调控机制13-14
• 1.3 SNAIL蛋白家族与EMT发生14-17
• 1.3.1 Snail蛋白14-15
• 1.3.2 Snail蛋白在EMT过程中的作用15-17
• 1.4 组蛋白甲基转移酶G9A与癌症发生17-18
• 1.4.1 组蛋白甲基转移酶G9a17
• 1.4.2 G9a与癌症发生17-18
• 1.5 论文意义与设计18-20
• 1.5.1 论文目的和意义18
• 1.5.2 实验设计18-20
• 第二章 实验材料和方法20-36
• 2.1 材料、试剂和仪器20-23
• 2.1.1 实验材料20-21
• 2.1.2 试剂和溶液21-22
• 2.1.3 主要仪器22-23
• 2.2 实验方法23-36
• 2.2.1 细胞培养23
• 2.2.2 EMT现象的诱导方法23
• 2.2.3 细胞总RNA的提取23-24
• 2.2.4 Realtime-PCR实验24-25
• 2.2.5 质粒构建25-29
• 2.2.5.1 Snail2的真核表达质粒构建25-27
• 2.2.5.2 G9a的真核表达质粒构建27-29
• 2.2.6 细胞转染29-30
• 2.2.7 样品制备30
• 2.2.8 Western blot及SDS- PAGE30-32
• 2.2.9 免疫共沉淀（Co-IP）32
• 2.2.10 染色质免疫共沉淀（Ch IP）实验32-36
• 第三章 实验结果36-50
• 3.1 人肝细胞发生EMT过程的细胞形态学变化36-39
• 3.2 肝细胞EMT过程中相关基因的表达水平变化39-40
• 3.3 SNAIL2基因在临床肝癌组织和癌旁组织中的表达差异40-41
• 3.4 SNAIL2和G9A相互作用41-48
• 3.4.1 Snail2全长，N端和C端质粒的构建42-44
• 3.4.1.1 Snail2全长的构建42-43
• 3.4.1.2 Snail2 N端和C端的构建43-44
• 3.4.2 G9a的N端和C端质粒的构建44-45
• 3.4.3 Snail2与G9a的试表达45-46
• 3.4.4 Snail2与G9a的相互作用46-48
• 3.5 Snail2和G9a在肝细胞发生EMT过程中的作用机制48-50
• 第四章 结论与讨论50-52
• 参考文献52-57
• 作者简介57-58
• 致谢58

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