贝伐单抗通过内质网应激机制诱导肺癌A549细胞凋亡

发布时间：2017-08-02 09:32

  本文关键词：贝伐单抗通过内质网应激机制诱导肺癌A549细胞凋亡

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【摘要】：目的:观察贝伐单抗对肺癌A549细胞的影响,探索其作用机制。方法:1.贝伐单抗处理A549细胞,A549细胞用含量为10%胎牛血清的RPMI-1640培养,培养在温度37°C,CO2浓度5%的细胞培养箱中。贝伐单抗用灭菌注射用水稀释。细胞用浓度为0μM、1μM、5μM、25μM的贝伐单抗处理12、24、48或72小时。2.CCK-8法检测A549细胞增殖抑制,A549细胞接种到96孔板中(100μL/孔),用不同浓度(0μM、1μM、5μM、25μM)的贝伐单抗处理12、24、48、72小时后,每孔加入10μL的CCK-8溶液。在培养箱中继续孵育4小时,用酶标仪测定在450nm处的吸光值。每次处理重复三次,计算平均值。3.流式细胞技术检测A549细胞凋亡,A549细胞接种在60-mm平板过夜,用不同浓度(0μM、1μM、5μM、25μM)贝伐单抗处理24小时,PBS缓冲液洗涤三次,0.25%tryptan-EDTA消化。离心后,将细胞在0.5ml PBS中的悬浮。细胞用膜联蛋白V(Annexin V)和碘化丙啶(PI)染色,RNA酶和0.1%Triton X-100室温处理30分钟。用荧光激活细胞分选仪进行流式细胞分析。4.荧光实时定量PCR检测RNA表达,总m RNA的提取来自经不同浓度(0μM、1μM、5μM、25μM)贝伐单抗处理的细胞,使用Ambion RNA-queous试剂盒。高容量c DNA Archive试剂盒用来获得的m RNA的第一链c DNA。CHOP、caspase-4、IRE1、XBP-1的m RNA水平检测通过特异性基因表达测定试剂盒、实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测系统完成。5.蛋白免疫印迹技术检测蛋白表达,将细胞溶解,收集上清液,用已知的方法萃取胞浆蛋白或核蛋白。在电压为120m V的三盐酸聚丙烯酰胺凝胶,将蛋白转移到聚偏二氟乙烯印迹膜,膜上用特异性多克隆抗体做探针。从蛋白裂解液中取得相同的蛋白量进行电泳分析,β-actin做为内参。结果:1.贝伐单抗处理肺癌A549细胞12小时,表现出对细胞增殖的抑制作用轻微,但处理24小时后则显著诱导细胞凋亡,并呈剂量依赖性。与此相反,作为对照组的贝伐单抗(0μM)在对任一时间处理过的细胞系中没有显著抑制作用。这些数据表明,贝伐单抗可抑制A549细胞增殖。2.我们采用流式细胞仪评估贝伐单抗对A549细胞凋亡的影响。结果表明,在使用贝伐单抗处理24小时后,可显著诱导细胞凋亡,这表明贝伐单抗参与了导致细胞凋亡的信号通路。3.我们进一步研究了贝伐单抗通过内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)介导的途径诱导A549细胞凋亡的可能性。细胞内质网应激导致的未折叠蛋白反应((unfolded protein response,UPR)中,我们选取内质网应激上游肌醇需求酶1(inositol requiring enzyme 1,IRE-1)、X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)作为检测指标,内质网应激诱导性凋亡(endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis,ERSIA)信号通路中选取C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein,CHOP)、半胱天冬氨酸4(caspase-4)作为检测指标。结果表明,在RNA水平较对照组(0μM)而言,XBP-1在浓度为1μM、5μM、25μM各组的表达均明显增加,为2.196±0.101,4.605±0.413,2.532±0.185(p0.01);CHOP(25μM)组及caspase-4(5μM)组的表达也有小幅增加,为2.191±0.112,1.588±0.167(p0.05)。在蛋白水平,CHOP的表达水平较对照组(0μM)0.33±0.08而言,浓度为1μM、5μM、25μM各组的表达均明显增加,为0.67±0.08,1.52±0.24,1.32±0.31(p0.05);caspase-4的表达较对照组(0μM)0.24±0.08而言,浓度为5μM、25μM两组的表达均有增加,为0.65±0.15,0.63±0.23(p0.05)。我们的数据显示贝伐单抗激活了内质网应激诱导性凋亡级联反应。结论:1.贝伐单抗在体外可抑制肺癌A549细胞增殖2.贝伐单抗在体外可促进肺癌A549细胞凋亡3.贝伐单抗在抑制肺癌A549细胞增殖以及在促进肺癌A549细胞凋亡过程中,出现了内质网应激相关通路的活化。4.贝伐单抗通过加重细胞内质网应激程度诱导肺癌A549细胞凋亡。
【关键词】：贝伐单抗 内质网应激 A549细胞 凋亡
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 主要缩略词简表13-14
• 第1章 前言14-16
• 第2章 材料与方法16-28
• 第3章 实验结果28-32
• 第4章 讨论32-36
• 第5章 结论36-38
• 参考文献38-42
• 附图42-50
• 综述50-60
• 参考文献56-60
• 攻读硕士学位期间撰写论文60-62
• 致谢62

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本文编号：608640