缺氧诱导胃癌AGS细胞中microRNA-574-3p表达的研究

发布时间：2017-08-02 18:21

  本文关键词：缺氧诱导胃癌AGS细胞中microRNA-574-3p表达的研究

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【摘要】：研究背景:胃癌是一种很常见的恶性肿瘤,在我国消化道恶性肿瘤发生率中处于第一位,而死亡率在我国恶性肿瘤中也排名第三位。胃癌死亡率高的原因大多数是由于早期胃癌不容易被发现,而晚期胃癌的浸润和转移则是影响其预后的关键因素。当肿瘤形成时,肿瘤周围所处的微环境是肿瘤生长、转移和预后的一个重要因素。而这种微环境很容易使胃癌细胞处于一个缺氧的状态,引发缺氧诱导因子的表达。缺氧诱导因子在肿瘤细胞中是非常重要的转录因子,它是许多肿瘤发生发展过程中的重要基因,其中缺氧诱导因子调控micro RNA(mi RNA)的表达。有关mi RNA的报道有很多,它在肿瘤的整个形成过程,包括生长、转移、浸润、分化、凋亡等过程中都起着调控作用。我们今天来探讨胃癌AGS细胞在缺氧状态下mi R-574-3p表达。材料和方法:本文采用了胃癌细胞系AGS细胞作为研究的基础,通过用Co Cl2刺激和在缺氧培养箱的培养下来完成本实验的所有研究。实验通过不同Co Cl2的浓度来摸索最适浓度,根据不同氧气浓度来摸索最适的一种缺氧状态,分别采用最适浓度Co Cl2(200mM)和最适氧气(5%O2)来进一步研究。我们采用干扰和激活HIF-1α的表达正反两方面来研究,采用HIF-1α抑制剂和si-RNA的方法来从反面证实HIF-1α能够引起mi R-574-3p的上调,我们转染稳定表达HIF-1α的质粒,通过在常氧下稳定表达HIF-1α来看mi R-574-3p的表达情况。我们采用双荧光素酶报告系统确定HIF-1α能够直接作用于mi R-574-3p上游启动子区域。我们通过瞬转mi R-574-3p看AGS细胞内HIF-1α的表达情况。结果:首先我们利用在环境中缺氧和氯化钴模拟缺氧的状态下发现mi R-574-3p的表达增加,在氯化钴刺激下,三次的统计结果分析:mi R-574-3p表达量增加了2.18倍;而在缺氧状态下,三次的统计结果分析:mi R-574-3p表达量增加了1.93倍;为了进一步证实mi R-574-3p的增加是由HIF-1α引起的,我们采用了抑制剂和si-RNA通过阻断HIF-1α的表达来证实此问题。三次结果分析:在氯化钴和缺氧状态下抑制剂分别降低约40%和29%,而在氯化钴和缺氧状态下si-RNA分别降低约30%和36%。而且我们还采用了转染HIF-1α的质粒,我们发现转染质粒后mi R-574-3p的表达量增加了2.15倍;我们试用双荧光素酶报告系统检测后,HIF-1α直接mi R-574-3p上游约1000bp的启动子区域结合。我们瞬转mi R-574-3p质粒会引起HIF-1α的表达增加1.3倍。结论:研究表明缺氧条件下通过HIF-1α能够上调胃癌AGS细胞的mi R-574-3p表达,并且HIF-1α直接作用于mi R-574-3p上游启动子区域,mi R-574-3p表达的增加可以上调HIF-1α的表达量,缺氧上调mi R-574-3p的表达可能对缺氧激活的HIF/VEGF通路有正反馈调控作用。
【关键词】：缺氧 HIF-1α AGS miR-574-3p
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 第1章 绪论12-20
• 1.1 胃癌及其危害12-13
• 1.2 缺氧诱导因子13-16
• 1.2.1 转录因子13
• 1.2.2 缺氧诱导因子13-14
• 1.2.3 缺氧诱导因子的成员及结构14
• 1.2.4 缺氧诱导因子的功能和作用机制14-15
• 1.2.5 缺氧诱导因子的临床意义15-16
• 1.3 microRNA16-18
• 1.3.1 miRNA的发现和命名16
• 1.3.2 miRNA的生物合成16-17
• 1.3.3 miRNA的功能及作用机制17-18
• 1.3.4 miRNA的应用18
• 1.4 肿瘤细胞的分子调控18-20
• 第2章 HIF-1α与miRNA5743p在胃癌AGS细胞的研究20-44
• 2.1 仪器和材料20-23
• 2.1.1 主要仪器20-21
• 2.1.2 主要试剂和耗材21-23
• 2.1.3 主要试剂配制23
• 2.1.4 细胞株来源23
• 2.2 实验方法23-32
• 2.2.1 胃癌AGS细胞培养23-24
• 2.2.2 光镜下观察AGS细胞的形态24
• 2.2.3 缺氧培养条件24
• 2.2.4 Western Blot法检测相关蛋白表达24-28
• 2.2.5 RNA提取28
• 2.2.6 RNA定量28-29
• 2.2.7 DNA&RNA转染29
• 2.2.8 逆转录反应29-30
• 2.2.9 PCR反应30-31
• 2.2.10 实时定量PCR反应31
• 2.2.11 琼脂糖凝胶电泳31
• 2.2.12 双荧光素酶报告系统31
• 2.2.13 质粒的提取31-32
• 2.3 数据处理32
• 2.4 实验结果32-44
• 2.4.1 CoCl_2和缺氧环境下AGS细胞的形态学变化32-33
• 2.4.2 CoCl_2或缺氧环境下AGS细胞HIF-1α蛋白的水平33-34
• 2.4.3 CoCl_2刺激上调AGS细胞中VEGF mRNA的表达34-35
• 2.4.4 CoCl_2或缺氧环境下AGS细胞中miR5743p的表达35-36
• 2.4.5 HIF-1α的抑制剂能够抑制miR5743p的表达36-38
• 2.4.6 si-HIF-1α能够抑制miR5743p的表达38-39
• 2.4.7 pcDNA3-HIF-1α(Mut)质粒的酶切验证39
• 2.4.8 转染pcDNA3-HIF-1α（Mut）质粒的蛋白表达39-40
• 2.4.9 转染pcDNA3-HIF-1α（Mut）质粒上调miR5743p的表达40-41
• 2.4.10 双荧光素酶报告基因的验证41-42
• 2.4.11 转染pEGFP(C1)-miR574质粒检测其的表达42-43
• 2.4.12 转染pEGFP(C1)-mi R574质粒上调HIF-1α的表达43-44
• 第3章 讨论44-46
• 第4章 结论46-47
• 参考文献47-52
• 在学期间获得的研究成果52-53
• 致谢53

【参考文献】

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1 Chao Li;Da-Ren Liu;Guo-Gang Li;Hou-Hong Wang;Xiao-Wen Li;Wei Zhang;Yu-Lian Wu;Li Chen;;CD97 promotes gastric cancer cell proliferation and invasion through exosome-mediated MAPK signaling pathway[J];World Journal of Gastroenterology;2015年20期

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本文编号：610642