食管鳞癌差异表达蛋白相互作用网络分析

发布时间：2017-08-03 10:21

  本文关键词：食管鳞癌差异表达蛋白相互作用网络分析

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【摘要】：背景:2014年“世界癌症报告”报道,中国每年食管癌(Esophageal Cancer,EC)新增和死亡病例居全球首位,其中90%组织学上属于食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。近20年来,EC患者的总体五年生存率却无显著变化,仍徘徊于15%-25%。EC预后差的主要原因在于多数病人首次确诊时已发展至中晚期,并且至少50%病人已有远处转移发生。因此,阐明ESCC发病因素及发生发展的分子机制,筛选鉴定ESCC特异敏感的生物标志物,探索新的治疗靶点和治疗手段,对降低ESCC发病率及死亡率具有重要的理论意义及临床应用价值。蛋白作为生命活动的最终承载者,在疾病发生发展过程中具有重要的生物学功能。蛋白与蛋白通过多种方式相互作用而形成复杂的蛋白-蛋白相互作用网络,参与正常生命活动的维系。病理状态下,蛋白-蛋白相互作用网络也随之发生动态变化。因此,单个蛋白的改变很难反映机体的生理或病理状态,造成单个异常分子诊断疾病的特异性、敏感性有限。质谱、蛋白芯片及生物信息学技术的应用,使我们能够从系统生物学角度理解生命及疾病过程的本质。此外,基于质谱技术的蛋白质组学具有重复性差、样品依赖度高和蛋白序列覆盖率低等缺陷。因此,需要寻找另外的方法来弥补这些不足,并同时提高鉴定低丰度蛋白的可能性。蛋白-蛋白相互作用网络分析不仅能够提供蛋白质分子功能、生物学通路及过程等信息,还能够在一定程度上弥补蛋白质组学研究的不足。目的:1应用i TRAQ标记及质谱定量技术分析ESCC及癌旁形态学正常食管黏膜上皮组织差异表达蛋白谱;2对上述差异表达蛋白进行基因本体(Gene ontology,GO)富集分析,确定与肿瘤相关的种子蛋白并绘制种子蛋白与蛋白间相互作用网络,通过网络拓扑学结构分析确定关键节点/瓶颈蛋白,并对其进行KEGG通路富集分析;3确定ESCC候选标志物纤维连接蛋白(Fibronectin,FN1)、肌动蛋白结合蛋白(Transgelin,TAGLN)、整合素β1(Integrinβ1,ITGB1)、14-3-3ζ(YWHAZ)在ESCC中的表达特征及临床意义。材料与方法:1分别提取10例ESCC及癌旁组织(来源于林州市肿瘤医院)蛋白,Bradford法测定蛋白浓度,取各例标本等量蛋白分别制备ESCC和癌旁组织混合蛋白标本,并进行i TRAQ标记、质谱定量分析ESCC相关蛋白表达(3次生物重复);根据平均差异倍数≥1.2倍及肽段≥2个确定差异表达蛋白列表;2应用Bin GO对243个差异表达蛋白进行GO功能富集分析,选取与肿瘤十大特征相关的117个蛋白为种子蛋白,搜寻STRING(http://www.string-db.org/)数据库中构建蛋白-蛋白相互作用网络;应用HUBBA网站(http://hub.iis.sinica.edu.tw/Hubba/index.php)中“度(DEGREE)”和“瓶颈(BOTTLE NECK)”算法分析蛋白网络的节点蛋白和瓶颈蛋白,并选取大于得分均值的蛋白为关键蛋白,Clue GO分析关键蛋白的KEGG通路特征;根据癌蛋白紧临及协同作用原则,由关键蛋白确定ESCC候选蛋白。3应用Western blot方法分析ESCC候选蛋白在ESCC组织中的表达:配制积层胶和分离胶,取等量癌与癌旁组织蛋白分别混合SDS上样缓冲液进行蛋白电泳,经转印,牛奶封闭,孵育一抗,二抗,显色曝光、显影、定影,最终结果灰度分析定量分析表达差异。4采用SPSS17.0统计软件处理,Western blot半定量结果分析采用配对t检验,P0.05具有统计学意义。结果:1本实验最终鉴定了243个以平均差异倍数≥1.2倍及肽段≥2个为判定标准的差异表达蛋白,包括ESCC中高表达蛋白119个和低表达蛋白125个;2 243个差异蛋白的GO富集分析结果表明:经“超几何检验”分析,“FDR”多重检验校正,显著水平P0.0001的GO条目有123个;与肿瘤十大特征(包括独立信号系统;抑制生长信号降低;减少细胞死亡;无限分裂特性;促进血管发育;组织浸润转移;逃脱免疫监视;促进炎症形成;异常能量代谢;遗传物质突变不稳定)显著相关的有17个GO条目,从而确定该条目包括的117个蛋白为种子蛋白;通过117个种子蛋白搜索STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用网络,该117个节点蛋白共包括255条相互作用;3网络拓扑学分析该网络各个节点的拓扑学评分,得到36个关键瓶颈蛋白和39个关键中心节点蛋白;上述关键蛋白整合经KEGG通路分析表明该蛋白在11条通路显示重要作用,分别为:黏着斑、蛋白酶体、细胞外基质受体相互作用、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、致病性大肠杆菌感染、阿米巴病、白细胞跨内皮迁移、心肌收缩、致心律失常性右室心肌病、补体和凝血级联反应;与公认癌基因比对得到直接相互作用且拓扑学评分较高的蛋白作为候选蛋白,包括:Fibronectin、Transgelin、Integrinβ1、14-3-3ζ;4 Western blot结果:ESCC中Fibronectin和Integrinβ1表达显著升高,而Transgelin的表达却明显降低;14-3-3ζ在ESCC中的表达具有降低趋势,但统计学分析无显著性。结论:1本实验确定的ESCC候选标志物Fibronectin、Transgelin和Integrinβ1与ESCC显著相关,其临床意义及参与ESCC发生发展的机制需进一步的研究阐明。
【关键词】：食管鳞癌 生物信息学 蛋白-蛋白相互作用网络 肿瘤蛋白 Fibronectin Transgelin Integrinβ1 14-3-3ζ
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 缩略词表12-13
• 1 引言13-15
• 2 实验仪器与试剂15-19
• 2.1 试剂配方及配置15-18
• 2.2 主要仪器试剂18-19
• 3 实验方法19-26
• 3.1 ESCC标本19
• 3.2 ESCC及癌旁组织蛋白的提取19
• 3.3 BRADFORD法浓度测定19-20
• 1) 标准曲线制备19-20
• 2) 待测样品处理及检测20
• 3) 蛋白浓度计算20
• 3.4 ITRAQ标记消化肽段并检测20-21
• 3.5 生物信息学筛选21-23
• 1) Gene Ontology分析21-22
• 2) Network Analysis22-23
• 3.6 蛋白电泳23-25
• 3.7 细胞迁移25-26
• 4 实验结果26-37
• 4.1 确定食管鳞癌差异蛋白表达谱26
• 4.2 GO分析结果26-30
• 4.3 相互作用网络30-31
• 4.4 网络拓扑学结构分析结果31-33
• 4.5 通路分析结果33-34
• 4.6 癌基因比对结果34
• 4.7 筛选关键蛋白验证结果34-35
• 4.8 TRANSGELIN蛋白的功能验证35-37
• 5 讨论37-43
• 6 结论43-45
• 参考文献45-49
• 综述49-61
• 参考文献56-61
• 致谢61-62

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