miR-26a靶向GSK-3β调控β-catenin信号通路增强肺癌细胞转移潜能的机制研究

发布时间：2017-08-04 12:23

  本文关键词：miR-26a靶向GSK-3β调控β-catenin信号通路增强肺癌细胞转移潜能的机制研究

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【摘要】：肺癌,尤其是非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)在世界范围内是造成肿瘤相关性死亡最常见的原因,据WHO统计2013年约占男性肿瘤死亡的28%,女性的26%。肺癌发病患者当中,非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌患者总数的75%-80%,主要包括三种病理组织学类型,分别为肺腺癌(Adenocarcinoma,CA)、肺鳞状细胞癌(squamous cell carcinoma,SCC)和大细胞癌(large-cell carcinoma,LCC)。据2008年全球肿瘤统计,肺癌是临床诊断最常见的癌症,在男性癌症相关死亡原因中居首位。在女性中,肺癌是第四个最常见的诊断癌症和第二大肿瘤相关死亡原因。在所有这些肺癌患者中处于疾病进展期或已经发生转移的病例高达65%以上。侵袭转移已经成为肿瘤治疗失败的重要原因,是肿瘤治疗亟需解决的关键难题之一。microRNAs(miRNAs)是一类长度大约由19-25个核苷酸构成的非编码小分子RNA,目前研究发现它可以通过多种生物学机制调节靶基因的表达,但microRNAs发挥作用的具体机制目前仍不十分清楚。microRNA最初被作为基因附属物被发现,最终认为它是基因组的重要组成部分被命名为微小RNA基因组,它们被认为是人类基因组中未被探明的黑暗神秘物质。作为新的非编码RNA库中的成员,microRNAs通过与靶基因mRNA的3’-UTR(Untranslated Region)域结合,从而使靶基因降解或者抑制转录后翻译来影响靶蛋白的表达。microRNAs异常表达已经在很多肿瘤中被发现,包括在肺癌组织等。近年来许多研究表明,microRNAs与肿瘤的侵袭转移有关。一些功能性研究发现miR-26a在肿瘤的发生发展中有重要作用,并取得了一定的研究进展。在本实验研究中,我们进一步探讨了miR-26a靶向调控GSK-3?通过?-catenin信号通路对肺癌细胞侵袭转移潜能的影响。前期研究中我们应用实时荧光定量PCR技术检测发现miR-26a在肺癌细胞系中的表达水平较正常支气管上皮细胞系降低,在肺原位癌组织和肺淋巴转移癌组织中较正常肺组织表达降低,但肺淋巴转移癌组织较原位肺癌组织表达增高。进而应用划痕和Transwell小室实验检测了miRNA-26a靶向PTEN通过AKT通路促进肺癌细胞侵袭迁移。应用细胞活力计数分析实验检测了miR-26a对肺癌细胞增殖活力无影响。因为mi RNA功能涉及多个基因多条通路的复杂性,为了进一步了解mi R-26a对肺癌侵袭转移的功能,本实验中我们采用生物信息学软件预测了miR-26a潜在的靶基因GSK-3?,进而应用荧光素酶报告基因实验验证了mi R-26a靶向于GSK-3?基因的3’-UTR区,Western-blot法检测miR-26a靶向抑制GSK-3?的蛋白表达。最后应用蛋白印迹Western-blot法检测了GSK-3?下游靶蛋白?-catenin的表达变化,检测了miR-26a作用于GSK-3?进而对?-catenin发生核内转位和侵袭转移相关基因C-myc/Cyclin D1表达变化的影响。综合我们的数据显示mi R-26a在肺癌组织中较癌旁正常组织中表达下调(***P0.001),差异具有统计学意义。miR-26a在肺癌淋巴结转移组织中的表达水平高于原发肺癌组织(**p0.01),差异有统计学意义。通过对细胞增殖活力分析实验研究表明转染100nM和200nM mi R-26a模拟物对肺癌细胞增殖没有影响。侵袭转移功能性实验划痕和小室实验研究证实:通过瞬时转染法将miR-26a模拟物和抑制剂转染肺癌细胞,结果显示miR-26a的表达水平能够显著影响癌细胞的侵袭转移能力,过表达miR-26a促进肺癌细胞的侵袭转移,抑制miR-26a的表达降低肺癌细胞的侵袭转移能力。物信息学软件初步预测GSK-3?是miR-26a的直接作用靶点,进一步荧光素酶报告基因实验及Western-blot法证实GSK-3?是mi R-26a的直接靶点。分子机制研究揭示miR-26a增强GSK-3?的磷酸化水平,降低GSK-3?总蛋白的表达水平,进而上调?-catenin的表达,并促进?-catenin蛋白向肺癌细胞核内转移,从而激活WNT/?-catenin信号通路。我们还检测了miR-26a对?-catenin信号通路的下游调控基因C-myc、Cyclin D1的表达变化。Western-blot法和Real-time PCR法的结果证实miR-26a促进侵袭转移相关基因C-myc、Cyclin D1、?-catenin、MMP-2、VEGF、Twist等表达上调。本研究揭示了miR-26a促进肺癌侵袭转移的新机制,即通过调控其靶基因GSK-3?,促进?-catenin表达及核内转位,进而激活Wnt/?-catenin信号通路,影响下游侵袭转移相关基因C-myc、CyclinD1的表达,功能性研究也更加清晰的表明miRNA-26a通过靶向GSK-3?增强肺癌细胞侵袭转移潜能。以上研究为miR-26a作为肿瘤侵袭转移的治疗靶点奠定了基础,后续研究将通过动物体内模型对其作用及其机制进行深入研究。
【关键词】：miR-26a GSK-?? 肺癌 侵袭转移 ?-catenin
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 缩略语/符号说明11-12
• 前言12-16
• 研究现状及目的12-14
• 实验设计路线图14-15
• 研究内容和拟解决的关键问题15-16
• 第一部分：实验材料和实验仪器16-23
• 1. 实验材料16-20
• 2. 实验仪器20-23
• 第二部分：课题组前期工作23-30
• 1. mi R-26a在肺癌组织及肺癌细胞系中的表达23-24
• 2. mi R-26a对肺癌细胞增殖及侵袭转移的功能性影响24-28
• 3. mi R-26a对侵袭转移相关基因的影响28-29
• 4.讨论29-30
• 第三部分：mi R-26a靶点GSK-3b的预测及验证30-51
• 1. miR-26a作用靶点GSK-3b的预测30-33
• 1.1 实验方法30-33
• 1.2 实验结果33
• 2. mi R-26a靶向GSK-3b荧光素酶报告基因实验33-45
• 2.1 实验方法33-44
• 2.2 实验结果44-45
• 3. mi R-26a调控GSK-3b蛋白表达变化的研究45-50
• 3.1 实验方法45-49
• 3.2 实验结果49-50
• 4. 讨论50-51
• 第四部分：mi R-26a靶向GSK-3b调控b-catenin信号通路促进肺癌细胞侵袭转移潜能的机制研究51-89
• 1. miR-26a靶向GSK-3b调控b-catenin蛋白表达52-58
• 1.1 实验方法52-57
• 1.2 实验结果57-58
• 2. mi R-26a调控b-catenin蛋白核转位的研究58-60
• 2.1 实验方法58-59
• 2.2 实验结果59-60
• 3. mi R-26a调控b-catenin通路转移相关基因C-myc/Cyclin D1的研究60-71
• 3.1 实验方法60-69
• 3.2 实验结果69-71
• 4. mi R-26a靶向GSK-3b促进肺癌细胞侵袭转移71-85
• 4.1 实验方法71-81
• 4.2 实验结果81-85
• 5. 讨论85-89
• 参考文献89-94
• 发表论文及参加科研情况说明94-95
• 综述 microRNA调控肿瘤耐药的研究进展95-116
• 综述参考文献109-116
• 致谢116-117

【共引文献】

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本文编号：619569