二氢杨梅素对非小细胞肺癌A549细胞体外抗肿瘤作用研究

发布时间：2017-08-05 04:09

  本文关键词：二氢杨梅素对非小细胞肺癌A549细胞体外抗肿瘤作用研究

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【摘要】：目的:肺癌是人类发病率和死亡率最高的恶性肿瘤,放射治疗是其重要的治疗手段之一。但是放疗带来的正常组织损伤也很重,放射治疗后部分恶性肿瘤细胞还会出现不同程度的治疗抵抗。因此寻找低毒高效的抗肿瘤新药和放疗增敏剂迫在眉睫。二氢杨梅素(dihydromyricetin,DMY)是近几年新发现的一个黄酮类化合物,有研究显示DMY在体内外均能发挥抗肿瘤作用,并且低毒高效,同时还有保护肝脏、降血脂、抗氧化、提高免疫力等优点,另外也有大量研究表明黄酮类化合物存在放疗增敏的作用。那么作为黄酮类化合物的DMY很有可能会成为一种低毒高效的抗肿瘤药物和肿瘤放疗增敏剂,为肺癌的治疗提供新思路,同时也为我国天然植物药物在抗癌方面的开发应用提供进一步资料。方法:1体外培养A549细胞,并稳定传代,取对数期细胞进行实验。2取对数生长期细胞制备单细胞悬液,按照5000个每孔的数量接种于96孔板,孵育24h后,当细胞贴壁良好,约30%-40%密度时,分别换成含不同浓度(0、20、40、60、80、100、140、200μg/ml)DMY的培养基继续孵育,48h后采用MTT比色法检测不同DMY浓度组A549细胞的增殖活力,计算得出IC50。3按照5000个每孔的数目接种细胞于96孔板,并用不同浓度(0、20、40、60、80、140μg/ml)DMY作用培养48h后,于倒置显微镜下检测和观察不同浓度DMY对细胞形态和生长状态的影响。4按照不同的初始接种密度(1×103、5×103、10×103、50×103、100×103、500×103个每孔)将细胞分别接种到6孔板中培养24h,当细胞贴壁伸展良好时,并换成含40μg/ml DMY的完全培养基继续孵育,48h后取出于倒置显微镜下观察相同浓度DMY对不同接种密度细胞的作用,并拍照记录。5按照400个/孔的数量将细胞接种于6孔板中培养,24h后当细胞贴壁伸展良好时,分别用不同浓度(0、6、7、8、9、10、12、15μg/ml)的DMY作用48h后继续培养,观察克隆形成情况,检测DMY对于A549细胞的长期抑制作用,并计算得出细胞存活分数和IC50。6流式细胞术凋亡试剂盒检测不同浓度(0、20、40、80μg/ml)DMY作用48h后对A549细胞的诱导凋亡作用。7 Western Blotting检测不同浓度(0、20、40、80μg/ml)DMY作用A549细胞48h后凋亡通路Bax和Bcl-2蛋白表达。8流式细胞术检测IC20浓度的DMY作用不同时间(6h、12h、24h、48h)对A549细胞周期时相的改变。9 IC20浓度的DMY预干预24h后,分别给予不同剂量(0、2、4、6、8Gy)的照射,并继续孵育培养,观察克隆形成情况,检测DMY对A549细胞体外放射治疗敏感性的影响。10应用统计学处理软件SPSS19.0进行单因素方差分析,数据以x±s表示,根据资料的目的和类型不同,采用单变量方差分析、单因素方差分析等处理数据。应用SNK-q检验进行方差分析两两比较。以P0.05为显著性检验标准。结果:1 MTT法检测显示不同浓度DMY作用48h后对A549细胞的增殖均出现明显的抑制作用(P0.05),且随着药物浓度的增高抑制作用越明显,呈剂量依赖关系。经IC50软件计算得出半数抑制浓度(IC50)约为64.45μg/ml。2随着DMY药物浓度的增加,倒置显微镜下可见细胞的固缩也越明显,生长能力下降甚至丧失。3相同浓度DMY作用不同接种密度的A549细胞后,镜下可见细胞密度越低,固缩现象越严重,提示DMY的抗肿瘤作用与细胞密度相关。4克隆形成实验结果显示,DMY浓度越高抗肿瘤作用越明显,IC50约在8.46μg/ml处。5流式细胞术凋亡实验显示DMY浓度越高A549细胞凋亡率越高。6 Western Blotting检测结果显示高浓度组DMY的Bax蛋白表达增高,而Bcl-2蛋白表达降低。7流式细胞术周期实验显示DMY干预后24h时A549细胞的G2/M期比率增高明显。8克隆形成增敏实验检测DMY预干预24h后对A549细胞的放疗增敏作用的结果并未见到显著增敏作用。结论:1 DMY对A549细胞体外存在抗肿瘤作用,并且随着药物浓度的增加抗肿瘤作用越明显。2另外DMY对A549细胞的抗肿瘤作用与给药时细胞的密度有关,细胞密度越低,DMY对A549细胞的抗肿瘤作用越强,细胞的生存能力与细胞密度有关,不同的实验方法时要注意细胞初始接种密度对药物效应产生的影响。3 DMY体外对A549细胞的抗增殖和诱导凋亡作用,与激活了Bax/Bcl-2参与调控的凋亡通路有关。4 DMY体外作用24h可以诱导A549细胞G2/M期比率显著增加。5本实验用DMY预干预24h后再照射,目前并未见到明显增敏作用。讨论:DMY体外对A549细胞抗肿瘤作用是否还存在其他机制,体内是否也存在抗肿瘤作用,DMY体外是否存在放疗增敏作用等问题需要进一步深入研究。
【关键词】：二氢杨梅素 肺癌 细胞增殖 凋亡 细胞周期 细胞密度 放疗增敏 克隆形成
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文缩写11-13
• 研究前言13
• 材料和方法13-22
• 结果22-25
• 附图25-33
• 附表33-34
• 讨论34-39
• 结论39-40
• 参考文献40-44
• 综述 放射治疗增敏研究进展44-50
• 参考文献47-50
• 致谢50-51
• 个人简历51

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 高倩;彭琼;甘惠中;袁媛;;白藜芦醇对BGC-823胃癌细胞株增殖抑制作用的体外研究[J];胃肠病学和肝病学杂志;2014年10期

2 顾生玖;李美波;朱开梅;;虎杖中白藜芦醇诱导肝癌细胞HepG-2凋亡及其对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响[J];中国实验方剂学杂志;2014年15期

3 朱惠平;张全安;苏沐;;姜黄素对人前列腺癌细胞放疗增敏作用的实验研究[J];中国现代医学杂志;2014年18期

4 刘伟;徐鑫;刘媛媛;刘斌;王喜梅;;喜泊分联合放疗对小鼠H22肝癌移植瘤的抑瘤增敏作用研究[J];中国生化药物杂志;2014年03期

5 岑钧华;;二氢杨梅素诱导肝癌细胞株HepG2凋亡途径的探讨[J];实用医学杂志;2014年11期

6 周防震;张新芳;;二氢杨梅素对4T1小鼠乳腺癌肺转移的抑制作用[J];中华临床医师杂志(电子版);2014年09期

7 刘涛;张雅雅;许英艺;包传恩;;槲皮素对人小细胞肺癌H446细胞增殖和凋亡的影响[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2014年02期

8 李艳茹;陆国辉;高健美;;甘草酸对人肺癌细胞A549凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响[J];中药药理与临床;2014年01期

9 张丹;韩苏夏;;放射治疗及放射治疗增敏研究进展[J];西部医学;2013年09期

10 吕向群;;青蒿琥酯对人结肠腺癌细胞的放射增敏作用[J];中国现代应用药学;2013年07期

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本文编号：623074