雷帕霉素对食管癌细胞TE13凋亡的影响及相关机制
发布时间：2017-08-05 22:19
本文关键词：雷帕霉素对食管癌细胞TE13凋亡的影响及相关机制
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【摘要】：食管癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,鳞状细胞癌是它最常见的组织学类型,我们国家是食管癌高发地国家。尽管临床上一直在改进食管癌的治疗手段与方法,但它的死亡率依然很高。通过多年对食管癌的研究,我们得知,它的发生发展是一个非常复杂的过程,这个过程有多基因的参与、多基因的作用,其中包括信号通路的异常活化。所以,食管癌治疗的关键仍然是研究抗癌药物及与其相关的信号通路。国内外多项研究证明,在多种肿瘤发生发展过程中,AKT/mTOR信号转导通路存在异常的激活。mTOR信号通路与细胞的生存、生长和增殖有关,还参与细胞内蛋白质合成的调节过程。mTOR是由2549个氨基酸组成的,它是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,它参加了很多细胞的重要功能的调节。P70S6K和4EBP1是mTOR下游两个重要的效应分子,是mTOR通路功能的主要执行者。该信号通路的活化通常表现出P70S6K和4EBP1的磷酸化。如果抑制mTOR通路,P70S6K和4EBP1的磷酸化过程受阻,进而抑制蛋白质的翻译过程,细胞周期就会停滞,最终诱导细胞凋亡。雷帕霉素(Rapamycin)属于大环内酯类药物,是mTOR的特异性抑制剂,具有杰出的抗肿瘤效果。研究表明,它对前列腺癌、乳腺癌及胰腺癌等恶性肿瘤均有一定疗效。但雷帕霉素是否对食管鳞状细胞癌的生长增殖有抑制作用及诱导凋亡的确切机制仍不清楚。本实验以食管鳞状细胞癌TE13细胞为模型,观察雷帕霉素对mTOR通路及细胞凋亡的影响,探讨食管癌的发生、发展机制,从而为我们临床对食管癌的治疗提高帮助。目的:探讨雷帕霉素对食管癌细胞TE13凋亡的影响及相关机制。方法:1用MTT方法检测不同浓度的雷帕霉素对TE13细胞增殖的影响。2用Western Blot方法分别检测不同浓度的雷帕霉素作用于TE13细胞后细胞内p-P70S6K、p-4EBP1蛋白的变化。3用Western Blot方法分别检测100nmol/l雷帕霉素作用于TE13细胞2h、6h、12h、24h、36h、48h后细胞内cIAP-1和BAD的蛋白表达。4采用流式细胞仪通过PI染色法检测不同浓度的雷帕霉素作用于TE13细胞后细胞的解析周期和细胞的凋亡率。5用TUNEL标记方法检查测量细胞凋亡的指数。6统计学方法处理。结果:1 MTT检测结果应用雷帕霉素作用于TE13细胞24h后,20、40、80、160、320、640nmol/L雷帕霉素对TE13细胞的抑制率分别为7.513±0.162%、14.004±0.714% 、16.089±1.650%、22.235±0.459% 、40.134±0.501%、52.423±0.673%,各个对照组明显高于对照组,差别具有统计学意义(P0.05)。提示雷帕霉素对TE13细胞生长有抑制作用,并具有浓度依赖性。2 Western Blot检测20、40、80、160 nmol/l雷帕霉素作用于TE13细胞24h后细胞内p-P70S6K、p-4EBP1蛋白表达变化。(1)随着药物浓度的升高,p-P70S6K蛋白的表达水平逐渐降低(0.714±0.045,0.606±0.023,0.552±0.020,0.332±0.022,P0.05),差别具有统计学上的意义。(2)随着药物浓度的升高,p-4EBP1蛋白的表达水平逐渐降低(0.952±0.085,0.866±0.068,0.692±0.059,0.462±0.019,P0.05),差别具有统计学上的意义。3 Western Blot检测100 nmol/l雷帕霉素作用于TE13细胞后2小时、6小时、12小时、24小时、36小时、48小时细胞内BAD和cIAP-1的蛋白表达的变化。(1)BAD蛋白表达的水平顺次升高(0.465±0.024,0.596±0.042,0.655±0.023,0.883±0.019,0.958±0.015,1.157±0.013,P0.05),差别具有统计学上的意义。(2)cIAP-1蛋白表达的水平顺次降低(0.842±0.013,0.717±0.017,0.645±0.021,0.514±0.014,0.469±0.026,0.218±0.018,P0.05),差别具有统计学上的意义。4流式细胞仪结果显示:分别用0、20、40、60、80、160 nmol/l浓度的雷帕霉素作用于TE13细胞24h后,细胞凋亡率逐渐升高(4.12±0.327%,5.67±0.206%,8.46±0.198%,10.97±0.440%,18.42±0.551%,23.60±0.754%,P0.05);细胞周期中出现G0/G1期的阻滞,G0/G1期细胞百分比由9.8±1.819%增加至61.5±2.394%,差异具有统计学意义。5 TUNEL标记法显示:正常细胞的细胞核不着色,而凋亡细胞的细胞核染色呈现棕黄色。0 nmol/l、40 nmol/l、80 nmol/l、160 nmol/l雷帕霉素处置TE13细胞24h,凋亡指数随用药浓度增加逐渐升高(5.67±1.435%,7.97±1.433%,35.79±2.886%,51.89±2.778%,P0.05),差异具有统计学意义。结论:1雷帕霉素可以抑制食管癌TE13细胞的生长,并以剂量依赖性方式诱导TE13细胞凋亡,雷帕霉素以时间依赖地诱导cIAP-1低表达和BAD蛋白高表达。2雷帕霉素通过抑制mTOR的下游底物P70S6K和4EBP1的活化诱TE13细胞凋亡,进而抑制食管癌细胞TE13的生长。
【关键词】：食管癌 TE13细胞株 雷帕霉素 mTOR通路 P70S6K 4EBP1 Western Blot 凋亡
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
【目录】：
- 中文摘要4-7
- 英文摘要7-11
- 英文缩写11-12
- 前言12-14
- 材料与方法14-23
- 结果23-25
- 附图25-30
- 附表30-33
- 讨论33-36
- 结论36-37
- 参考文献37-40
- 综述 雷帕霉素及其衍生物的研究进展40-49
- 参考文献45-49
- 致谢49-50
- 个人简历50
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本文编号：627212
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