GRK3在雄激素剥夺疗法诱导的神经内分泌型前列腺癌中的作用研究

发布时间：2017-08-07 22:02

  本文关键词：GRK3在雄激素剥夺疗法诱导的神经内分泌型前列腺癌中的作用研究

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【摘要】：前列腺癌是非常常见的男性生殖系统恶性肿瘤之一,在西方国家也是最常见的恶性肿瘤,尤其在美国,前列腺癌患者的发病率仍超过肺癌,高居第一位。近年来,在我国前列腺癌患者发病率逐渐呈增长趋势。前列腺癌由于症状隐蔽,至少50%的患者确诊时已为局部晚期肿瘤,治疗并预防转移对提高生存率尤为重要。转移和复发也是患者死亡的主要原因。神经内分泌细胞已被公认为是正常前列腺管道和腺泡的一个组成部分。近50%的临床型前列腺癌有神经内分泌细胞异变。神经内分泌型前列腺癌(neuroendocrine differentiation of prostate cancer,NEPC),也称为未分化小细胞癌,是一种高侵袭性前列腺癌的亚型。它可以是原发性的,但其大多数来自前列腺腺癌(Prostate adenocarcinoma,PCA)的晚期并进行激素治疗之后。神经内分泌型前列腺癌NEPC不同于前列腺癌PCA,NEPC的特点是存在神经内分泌(neuroendocrine,NE)细胞、不表达雄激素受体(androgen receptor,AR)、不分泌前列腺特异性抗原(prostate specific antigen,PSA),但通常高表达神经内分泌标志物,如嗜铬粒蛋白A(chromogranin A,CHGA)嗜铬粒蛋白B(chromogranin B,CHGB),突触小泡蛋白,特定神经元烯醇酶2(enolase 2,ENO2)。临床研究表明,患者长期应用雄激素剥夺疗法(androgen deprivation therapy,ADT)可诱导细胞发生神经内分泌转。因此去势抵抗型前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)的发生率,可能会随着临床引入雄激素剥夺疗法的增加而增加,导致一个高侵袭性、高转移性的临床过程。因此,阐明NEPC发生的分子机制以及开发NEPC的靶向治疗药物是目前前列腺癌领域的一个研究热点。最新研究表明,人类G蛋白耦合受体激酶3(G protein-coupled receptor kinases 3,GRK3)是前列腺癌细胞转移过程中所必不可少的激酶,促进前列腺癌细胞转移过程。因为NEPC是具有高转移性质的一种前列腺癌的亚型,因此,我们考虑是否GRK3在前列腺腺癌细胞的NE分化过程中是否也发挥了重要的作用。本研究中,我们通过无激素培养诱导前列腺腺癌细胞LNCa P向NE方向转化,制备了雄激素剥夺疗法(Androgen deprivation treatment,ADT)诱导的神经内分泌型前列腺癌细胞,命名为t-NEPC(ADT-induced NE differentiated cell line)。并研究了LNCa P向t-NEPC细胞转化的过程当中蛋白激酶GRK3的作用。该研究的目的是为了NEPC的治疗提供新的治疗靶点和实验依据。目的:制备ADT诱导的神经内分泌型前列腺癌细胞,并研究在前列腺腺癌细胞向神经内分泌转化的过程中蛋白激酶GRK3的作用,为NEPC的治疗提供新的治疗靶点和实验依据。方法:1细胞培养人类前列腺腺癌LNCa P细胞在含5%的胎牛血清、浓度分别为1%的谷氨酰胺和1%的青霉素和链霉素的RPMI1640培养液中培养。t-NEPC细胞在含5%的无激素胎牛血清、浓度分别为1%的谷氨酰胺和1%的青霉素和链霉素的无激素RPMI1640培养液中培养。2实验方法采用无激素RPMI1640培养基诱导人类前列腺腺癌LNCa P细胞向神经内分泌方向转化,成功制备人前列腺腺癌细胞来源的神经内分泌t-NEPC细胞,采用Real time PCR检测两种细胞当中PSA、AR以及NE标志物CHGA、CHGB和ENO2的表达变化,通过Real time PCR和western blot方法检测两种细胞中GRK3的表达变化。采用病毒感染方法建立稳定表达sh GRK3的t-NEPC细胞,并采Real time PCR方法检测敲低GRK3后t-NEPC细胞中NE标志物CHGA、CHGB和ENO2的表达变化。结果:1 ADT可诱导人类前列腺腺癌LNCa P细胞向神经内分泌方向分化首先我们通过在去激素的RPMI1640,含5%的胎牛血清、浓度分别为1%的谷氨酰胺和1%的青霉素和链霉素的培养基中,长期培养LNCa P细胞从而得到t-NEPC细胞。这些细胞是来源于长期用ADT治疗的人类前列腺腺癌LNCa P细胞。结果显示,LNCa P细胞显示上皮形态,而t-NEPC细胞可见包体变圆,周围出现很多神经元样细胞突触,细胞形态发生了变化。我们又通过实时定量PCR在LNCa P和t-NEPC这两个细胞系中比较AR的表达以及其目标基因前列腺特异性抗原(PSA)两种NE标记物的表达。结果显示,PSA在LNCa P细胞中的表达比在t-NEPC细胞中高出10倍,AR在LNCa P细胞比在t-NEPC胞中的表达也高出了5倍,在LNCa P细胞中CHGA上升了6倍,CHGB上升了4倍,ENO2上升了20倍。2 GRK3在人类前列腺腺癌向神经内分泌方向分化的表达变化我们研究了GRK3在LNCa P和t-NEPC细胞中的表达。Western-blot结果显示与LNCa P细胞相比GRK3在ADT-诱导的t-NEPC细胞中的蛋白水平明显升高;而通过实时定量PCR检测结果显示,ADT-诱导的t-NEPC细胞与LNCa P细胞相比显著上升了两倍.3敲除GRK3后对t-NEPC表型的影响我们用GRK3 sh RNA感染t-NEPC细胞后,首先观察了细胞的形态变化,细胞转染GRK3 sh RNA后,细胞触角减少,形态发生逆转变化,然后我们又通过实时定量PCR方法检测了t-NEPC shscramble和t-NEPC sh GRK3以此评估敲除GRK3实验是否成功,结果显示:t-NEPC sh GRK3组的表达明显低于对照组t-NEPC shscramble 3倍,GRK3 sh RNA被感染成t-NEPC细胞减少了内源性GRK3,GRK3敲除成功。我们进一步进行了NE标志物:CHGA CHGB和ENO2的表达,通过实时定量PCR分析t-NEPC sh GRK3较对照组t-NEPC shscramble的NE标志物的表达明显下降。结论:1 ADT可诱导人类前列腺腺癌LNCa P细胞向神经内分泌方向分化。2 GRK3促进了人类前列腺腺癌向神经内分泌方向分化。3敲低GRK3后t-NEPC表型发生了逆转变化,NE标记物CHGA、CHGB和ENO2的表达均明显下降。
【关键词】：GRK3 诱导 分化 t-NEPC 神经内分泌型前列腺癌
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.25
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 前言11-12
• 材料与方法12-18
• 结果18-20
• 附图20-25
• 讨论25-27
• 结论27-28
• 参考文献28-33
• 综述 前列腺癌神经内分泌化的研究进展33-41
• 参考文献37-41
• 致谢41-42
• 个人简历42

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1 张小冲;GRK3在雄激素剥夺疗法诱导的神经内分泌型前列腺癌中的作用研究[D];河北医科大学;2015年

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本文编号：636912