GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关差异LncRNA筛选及其研究

发布时间：2017-08-11 10:05

  本文关键词：GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关差异LncRNA筛选及其研究

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【摘要】：甲基丙烯酸环氧丙酯(Glycidyl Methacrylate, GMA)是一种缩水甘油醛的衍生物,既含有碳碳双键,又含有环氧基,可参与离子型和自由基型反应,反应活性高。它作为聚合反应的功能性单体,主要用于化工材料(树脂、涂料、粘合剂、塑料等)的合成,使相关产品具有优良的防紫外、耐水和耐热等特性。研究表明,GMA属低毒类,多项致突变实验(如Ames试验、体外哺乳动物细胞染色体畸变试验、哺乳动物微核试验)结果呈阳性,具有遗传毒性；GMA可诱导BALB/c3T3细胞、原代培养金仓鼠胚胎细胞、人胚肺细胞和16HBE人支气管上皮细胞等多种哺乳动物细胞发生恶性转化,具有潜在致癌性。长链非编码RNA (Long non-coding RNA, LncRNA)是一类长度大于200bp不具有编码蛋白质功能的RNA分子总称,可以在表观遗传修饰水平、转录水平、转录后加工以及翻译水平等多个层面上参与调控基因的表达。目前,LncRNA作用靶点及作用机制尚不清楚,但LncRNA参与的基因表达调控网络既重要而又非常复杂。研究证实LncRNA与人类的肿瘤密切相关,LncRNA差异表达于正常组织与肿瘤组织间,多种肿瘤的发生发展过程中伴随LncRNA异常表达,不同肿瘤某些特定LncRNA表达水平会发生改变。因此,特异性LncRNA可作为肿瘤的预测因子,其可作为肿瘤早期发现和诊断相关生物标志物。恶性肿瘤是由细胞恶性转化发展而来的,是细胞恶变增殖的结果,细胞发生恶性转化过程中也伴随LncRNA异常表达,提示识别细胞恶性转化相关特异LncRNA不仅有利于揭示环境化学物致细胞癌变的分子机制,也可将其作为环境化学物致细胞癌变的潜在分子标志。本研究在已完成的GMA致16HBE (human bronchial epithelial,人支气管上皮)细胞恶性转化过程中相关差异表达基因谱、甲基化基因及沉默基因筛选研究工作基础上,以8μg/mL GMA反复接触16HBE细胞,染毒3次,每次染毒72h,两次染毒间隔24h;以溶剂DMSO处理的同步培养的细胞为对照。染毒结束记为第0代,细胞长满后传代培养至30代,DMSO组同步进行。期间观察细胞形态学变化,并采用刀豆凝集素A (ConA)凝集试验和锚着非依赖性(AIG)试验进行细胞生物学特性鉴定。收集GMA诱导的16HBE恶性转化细胞(第30代)及同代龄DMSO溶剂对照组细胞,采用最新高通量Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0芯片,通过比较GMA诱导的16HBE恶性转化细胞与同代龄DMSO对照组细胞LncRNA表达差异,筛选GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关差异表达LncRNA以及差异表达LncRNA相关mRNA;对差异表达LncRNA相关mRNA进行GO和Pathway分析,初步探讨GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中差异表达LncRNA的功能,为探究LncRNA在GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中的作用机制提供可靠实验数据；通过LncRNA差异倍数及其相关邻近编码基因信息分析等策略筛选出目标LncRNA,经实时荧光定量PCR (qPCR)验证、分析,确定GMA诱导的恶性转化细胞相关特定LncRNA;对特定LncRNA进行生物信息学分析,利用基于生物信息学建立的以预测LncRNA功能及其靶基因为目的的数据库,进一步筛选出特定LncRNA相关mRNA,结合已完成的差异表达基因谱的研究结果进一步探讨特定LncRNA在GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中表达及对其蛋白编码基因调控作用。1 GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关差异LncRNA筛选GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中,与同代龄DMSO对照组细胞相比,共筛选出2664个差异表达的LncRNA,其中上调896个,上调倍数为2.0～198.8；下调1768个,下调倍数为2.0～262.1。同时检测发现2216个差异表达LncRNA相关的mRNA,其中上调706个,上调倍数为2.0～642.0；下调1510个,下调倍数为2.0～74.9。2 GMA诱导的16HBE恶性转化细胞差异表达LncRNA分析差异表达LncRNA相关mRNA的GO分析显示,差异表达LncRNA相关mRNA参与的分子功能注释的条目有166项,主要参与分子粘合物、蛋白结合物、核苷酸结合物、激酶活性、转移酶活性及受体结合物等功能；差异表达LncRNA相关mRNA参与的生物学过程注释的条目有869项,主要参与细胞周期、新陈代谢、细胞代谢及有机物代谢等功能;差异表达LncRNA相关mRNA参与的细胞组成注释的条目有20项,主要参与调控细胞、细胞核、细胞膜、膜元件、细胞质和细胞器等。差异表达LncRNA相关mRNA的Pathway分析显示,在GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中有25条和17条分别受上调和下调mRNA调控,其中,上调mRNA主要参与调控与错位修复、DNA复制、震颤性麻痹等功能相关的通路,下调mRNA主要参与调控与蛋白的消化吸收、刺激神经组织的受体和配体相互作用、细胞黏附分子等功能相关的通路。3目标LncRNA的验证及其功能探讨GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中,与同代龄DMSO对照组细胞相比,LncRNA芯片结果显示,PCA3、CTBP1-AS1和CDKN2B-AS1表达分别上调7.17、2.20和5.39倍,经qPCR确证,PCA3、CTBP1-AS1表达量与芯片结果一致,提不PCA3、CTBP1-AS1可作为GMA致16HBE细胞恶性转化相关特定LncRNA;根据生物学信息预测及相关文献报道分析,确定PCA3和CTBP1-AS1最可能的相关蛋白编码基因分别为PRUNE2和CTBP1,LncRNA芯片显示,PRUNE2下调2.54,CTBP1上调1.26倍,差异表达基因谱结果与LncRNA芯片所获结果一致,提示LncRNA PCA3、CTBP1-AS1可能是通过调控其蛋白编码基因的表达而起作用,推测LncRNA PCA3、CTBP1-AS1可能是GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关特异分子标志。综上所述,以8μg/mL GMA反复接触16HBE细胞,可诱导16HBE细胞发生恶性转化,转化细胞具备恶性生物学特性；与同步培养的DMSO对照细胞相比,GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中存在多个异常表达LncRNA及其相关mRNA;对差异表达LncRNA相关mRNA进行GO和Pathway分析提示,差异表达mRNA参与了多项GO条目及通路的调控,为深入探讨LncRNA在GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中的作用机制提供可靠实验数据；LncRNA芯片、qPCR法及前期差异表达基因谱结果提示,特定LncRNA PCA3、CTBP1-AS 1可能是通过调控其蛋白编码基因的表达而起作用,推测LncRNA PCA3、CTBP 1-AS 1可能是GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关特异分子标志。
【关键词】：甲基丙烯酸环氧丙酯 人支气管上皮细胞 LncRNA芯片 PCA3 CTBP1-AS1 全基因组表达谱芯片
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2
【目录】：

• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 英文缩略词表13-14
• 前言14-17
• 第一部分 GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关差异LncRNA的筛选17-56
• 引言17-55
• 1 实验材料18-20
• 1.1 细胞转化试验18-19
• 1.2 LncRNA芯片筛选19-20
• 2 试验方法20-30
• 2.1 GMA诱导人支气管上皮细胞恶性转化20-22
• 2.2 GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关差异LncRNA的筛选22-29
• 2.3 质量控制29-30
• 3 结果30-52
• 3.1 GMA诱导的人支气管上皮细胞恶性转化结果30-32
• 3.2 GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关差异LncRNA筛选结果32-52
• 4 讨论52-55
• 小结55-56
• 第二部分 GMA诱导的16HBE恶性转化细胞差异表达LncRNA的分析56-64
• 引言56-63
• 1 试验材料56
• 2 试验方法56-57
• 2.1 GO分析56-57
• 2.2 Pathway分析57
• 3 结果57-62
• 3.1 差异表达mRNA的GO分析57-60
• 3.2 差异表达mRNA的Pathway分析60-62
• 4 讨论62-63
• 小结63-64
• 第三部分 GMA诱导的16HBE恶性转化细胞中目标LncRNA的验证及其功能探讨64-73
• 引言64-73
• 1 试验材料64
• 2 试验方法64-66
• 2.1 RNA提取和质量检测64
• 2.2 制备用于绘制标准曲线的梯度稀释DNA模板64-65
• 2.3 进行Realtime PCR反应65-66
• 3 统计学分析方法66
• 4 结果66-70
• 4.1 LncRNA芯片结果66
• 4.2 质量检测结果66-67
• 4.3 PCA3、CTBP1-AS1、CDKN2B-AS1 qPCR的熔解曲线和扩增曲线67-69
• 4.4 PCA3、CTBP1-AS1、CDKN2B-AS1 qPCR法表达量结果69-70
• 4.5 PCA3、CTBP1-AS1最可能的mRNA的LncRNA芯片和表达谱芯片结果70
• 5 讨论70-73
• 小结73
• 总结73-76
• 参考文献76-81
• 致谢81-82
• 论著82-98
• 个人简历98

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6 刘红梅;GMA诱导的16HBE恶性转化细胞相关差异LncRNA筛选及其研究[D];中国疾病预防控制中心;2016年

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本文编号：655492