TIP30对巨噬细胞调控DEN诱导肝癌的影响及相关机制研究

发布时间：2017-08-13 21:39

  本文关键词：TIP30对巨噬细胞调控DEN诱导肝癌的影响及相关机制研究

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【摘要】：原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一。据报道,2000年全世界肝癌新发病例约为564000例,其中男性为398364例,女性为165972例。更为重要的是,近几年来肝癌的发病率呈现上升的趋势,肝癌已经成为HBV/HCV感染患者的最主要致死原因之一。纵观分布,肝癌高发区域主要集中在东亚东南亚及部分非洲地区,我国是肝癌大国,2011年新发病例约35.6万,发病率为26.39/10万。2000-2011年间,中国肝癌发病率平均每年升高1%,肝癌发病率仍呈上升趋势。原发性肝癌的发病机理非常复杂,不但受机体外部环境影响,也和机体本身基因因素明显相关。目前认为肝癌的发病机理是一个多阶段、多因素协同作用,经过启动、促癌和演进等多步骤过程,以及多个癌基因和相关基因参与,多个基因发生突变导致的肝脏慢性损伤和过度免疫所造成。肝炎病毒慢性感染是原发性肝癌的重要诱因,主要通过引起急、慢性肝炎、肝硬化,并在此基础上受到其他促癌因素的协同作用而导致。尤其是乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)与肝癌的关系甚为密切,20世纪70年代就已经发现,肝癌的发病率分布与慢性乙型肝炎病毒感染分布相一致,病理学观察也发现肝癌周围的非癌组织常常存在慢性肝炎。HBV的致癌机制目前还没能够完全探明,体外实验的结果发现肝炎病毒感染不能使细胞永生化或恶性转化,因此目前公认度最高的说法是主要通过炎症反应而激发细胞增生,此种炎症坏死激发的细胞增生可使DNA突变的概率大大增加,同时炎症反应所招募的活化的巨噬细胞产生大量可引起细胞损伤的自由基。实验证明化学物质二乙基亚硝胺(Diethylnitronamine, DEN)诱导肝癌形成的主要原因就是诱导肝损伤后慢性炎症反应和异常修复所造成。另外,饮用水污染物质、酗酒、肝毒性物质刺激如黄曲霉毒素等也可诱发肝癌。枯否氏细胞定位于肝窦状隙内,是机体最大的组织固定巨噬细胞群。枯否氏细胞的主要功能是通过吞噬作用清除来自门脉循环的外来物质,吸收并降解细胞内毒素。此外,枯否氏细胞还能作为抗原递呈细胞递呈抗原和分泌细胞因子来诱导T淋巴细胞进行免疫反应。肝脏病毒感染和化学损伤后产生的坏死碎片可激活肝内的枯否氏细胞,免疫激活后,枯否氏细胞可通过其表面的模式识别受体(如Toll样受体)与免疫原表面的PAMP(病原相关分子模式)结合,改变其本身的表现型和吞噬活性,伴随着释放超氧阴离子、过氧化氢、一氧化氮、水解酶及花生四烯酸等协助破坏抗原,同时分泌与免疫调节和细胞炎症反应相关的细胞因子,如白细胞介素1、白细胞介素6、肿瘤坏死因子TNF-α、血小板激活因子、转录生长因子、干扰素-γ等。枯否氏细胞介导的慢性炎症反应在各种化学药物和病毒感染导致的肝脏慢性损伤、修复中起关键作用,与原发性肝癌的发生直接相关。在乙型、丙型肝炎病毒的持续感染过程中发现大量枯否氏细胞的存在,肝炎病毒和化学物质导致的肝损伤、肝硬化、原发性肝癌与枯否氏细胞相关性较大。在DEN导致的肝脏损伤、再生修复、肝硬化和原发性肝癌形成过程中,枯否氏细胞也发挥了重要作用。所以从枯否氏细胞入手研究肝癌的发生机制十分必要。枯否氏细胞是肝脏巨噬细胞,本研究的入手点也是从巨噬细胞开始进行的。TIP30是一种分子量为30kD Tat(Transactivator of transcription)的结合蛋白(Tat interactive protein),也是RNA聚合酶Ⅱ的结合蛋白,可以磷酸化RNA聚合酶Ⅱ最大亚基C末端(carboxyl-terminal domain, CTD)的七肽重复序列,特异地调节基因转录。TIP30还可以作为特异性的共激活剂加强形成Tat-RNA聚合酶Ⅱ全酶复合物,发挥一系列生物学功能。由于可特异性地提高HIV-1增殖调节蛋白Tat的转录,因而又称为HTATIP2 (HIV-1 Tat interactive pr otein2)。随着研究的不断深入,还发现其具有调节细胞损伤修复、调节细胞对葡萄糖的耐受性、调控胞浆内分子运输等多项功能。早期的研究发现,TIP30基因作为一种抑癌基因参与肿瘤的发生发展,肺癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中可见TIP30表达下调。多种研究表明TIP30基因敲除可以诱发机体产生肿瘤,如肝癌、肺癌、卵巢癌、平滑肌瘤及膀胱癌等。课题组其他成员在前期实验中已经明确：TIP30基因敲除可抑制DEN诱导的小鼠肝肿瘤的发生,这与以往其他研究发现TIP30表现出的抑癌基因作用不符合。我们的前期研究中已发现,该作用可能是通过下调炎症反应相关的NFκB/IL-6/STAT3信号通路来实现。同时我们课题组还发现,在DEN处理后,TIP30基因敲除小鼠肝内巨噬细胞浸润明显少于野生型小鼠,肝内单核细胞趋化因子-1(Monocyte chemotactic protein-1,MCP-1)的转录水平也明显低于野生型小鼠。由此可知,这种DEN诱导下TIP30基因抑制原发性肝癌产生的作用可能与TIP30敲除后引起的巨噬细胞迁移浸润减少所致的炎症反应降低、肝组织纤维化减少有关。但TIP30基因下调是否与巨噬细胞内NFκB/IL-6信号分子有关,为何会引起巨噬细胞迁移浸润的降低,这一系列问题亟待阐明。本研究在前期实验的基础上,以巨噬细胞着手开展研究,目的是为了阐明TIP30基因影响巨噬细胞生物学功能及肝内浸润的相关分子基础,进一步探索TIP30影响原发性肝癌发生的可能分子机制。方法：1-以慢病毒为载体的TIP30 shRNA转染小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞针对TIP30基因设计并合成三对不同靶序列的shRNA,对RAW264.7的TIP30基因进行特异性干扰。用嘌呤霉素进一步筛选,于荧光显微镜下观察荧光表达情况,然后提取RAW264.7细胞蛋白,用免疫印迹检测被不同序列的shRNA干扰后的RAW264.7细胞中TIP30蛋白的表达量,并从中筛选出TIP30抑制率最高的细胞进行后续实验。2.免疫印迹收集细胞加入RIPA裂解液(已加入2ul PMSF)于4℃裂解20min,4摄氏度12000r/min离心20min,用BCA法测定蛋白浓度,加入适量5×loadi ng buffer,煮沸变性。蛋白溶液经电泳、转膜、以5%脱脂牛奶封闭,加入已稀释的合适浓度的一抗过夜。次日洗膜后孵育二抗1h,洗膜后曝光、分析。采用该法检测NFκB、磷酸化NFκB蛋白表达水平。3.荧光定量PCR用Trizol试剂抽提RAW264.7细胞中RNA,经过氯仿分相、异丙醇沉淀、75%乙醇洗涤、DEPC水重新溶解等步骤,提取出RNA并进行纯度测定、浓度调整。按TakaRa试剂盒逆转录得到cDNA,并进行PCR扩增。小鼠IL-6上游引物为：5'-AGAGGAGACTTCACAGAGGAT-33,下游引物为5'-TACTCCAG GTAGCTATGGTAC-33;小鼠ER-α上游引物为：5'-AGGCGGCATACGGAAA GAC-33,下游引物为：5'-CATTTCGGCCTTCCAAGTCA-33;小鼠β -actin上游引物为：5'-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-33,下游引物为5'-TTGATGTCA CGCACGATTTC-33.采用罗氏480仪器行PCR反应,反应结束后进行实验结果分析,用2-ΔΔCt方法计算相对值(表达量=2-(Ct(样品)-Ct(内参)),GraphPad Prism 5.0作图。采用该法检测IL-6 mRNA和ERa转录水平。4.鼠尾裂解法鉴定小鼠基因型于美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)购入C57BL/6的TIP30-/-纯合子小鼠(品系：B6.129P2-Htatip2tmlHx/J).与普通C57BL/6野生型杂交,取2周大的子代鼠尾(约2mm)行基因型鉴定。加入鼠尾裂解液(含蛋白酶K),经水浴并煮沸变性,常温下12000r/min离心2min,上清液即为DNA模板。TIP30基因鉴定的PCR引物如下：Mutant Reverse:GGCCTCTT CGCTATTACGC; Common:TGAGTCTCTTCTGCCCAACA; Wild Type Reverse:TAATGGACACCTTCCCCTCA。取样品DNA行普通PCR及琼脂糖凝胶电泳并分析结果。5.小鼠肝组织匀浆液的提取将TIP30-/-及TIP30+/+小鼠麻醉后,于超净台取出肝脏,漂洗,用电子天平精确称量等量肝组织,剪碎20min,加入1ml DMEM,匀浆,于4摄氏度12000×g离心20min,3-5次,每次离心后留取上清液,直至溶液完全澄清,该溶液即为含有趋化因子的肝组织匀浆液。6. transwell趋化实验选用8μm的transwell小室进行实验,上室加入实验组或对照组RAW264.7细胞,调整细胞密度为2×105,用无血清的DMEM培养；下室根据实验分组需要加入含所需趋化因子的DMEM。培养12h后,取出小室,拭掉上室残留细胞,无水甲醇固定,晾后以0.1%的结晶紫染色30min,置于显微镜下,计数迁移至下室的细胞,随机挑取8个视野,拍照,计数,进行统计学分析。7.染色质免疫共沉淀(ChIP)采用生物信息学分析SP-1和MCP-1启动子可能与TIP30基因结合的位点,设计PCR所需的合适的引物。采用pierce试剂盒进行操作,最后以荧光定量PCR验证结果。8.统计学分析应用SPSS 20.0软件进行统计学处理,计量资料以均数±标准差(x+s)表示。采用两独立样本t检验分析两样本间的差异,单因素的方差分析比较多个组的总体均数,两两比较时选用LSD-t或Bonferroni(方差齐)、Dunnett-t(方差不齐)。P0.05有统计学意义。结果：1. TIP30 shRNA-2片段干扰RAW264.7细胞后TIP30干扰效率最高：慢病毒包装的TIP30 shRNA转染RAW264.7细胞后,免疫荧光可证实各个组均已转入靶序列,采用免疫印迹实验检测各组TIP30 shRNA的干扰效率,结果表明,慢病毒包被的TIP30 shRNA-2干扰TIP30的表达水平较NC组显著降低(P0.001),TIP30 shRNA-1与TIP30 shRNA-3组与NC组无显著差异(P0.05),因而选取TIP30 shRNA-2所干扰的细胞株作为后续实验的实验组细胞株。2.TIP30基因下调可降低巨噬细胞P-NFκB、IL-6表达：免疫印迹分析发现,TIP30基因干扰的RAW264.7细胞表达P-NFκB水平低于野生型RAW264.7细胞(P0.05),且NFkB未见显著差异(P0.05)。荧光定量PCR检测IL-6转录水平,TIP30基因干扰的RAW264.7细胞的IL-6转录水平显著低于野生型RAW264.7细胞(P0.05)。3.TIP30基因下调可上调雌激素受体(ERa)转录：通过荧光定量PCR检测ERa mRNA水平,TIP30基因沉默的小鼠巨噬细胞RAW264.7的ERa mRNA是野生型RAW264.7细胞的1.77倍(P0.05)。4.TIP30与MCP-1启动子区结合但不与MCP-1上游的SP-1启动子区结合：染色质免疫共沉淀证实TIP30能与MCP-1基因结合,可能通过调节下游基因的转录,直接影响巨噬细胞迁移,但TIP30不能与MCP-1的上游基因SP-1结合参与间接调控MCP-1。6.TIP30基因下调不仅直接使巨噬细胞本身的迁移能力降低,而且可能通过减少MCP-1等趋化因子的分泌而降低其迁移浸润能力：transwell实验证实,当上室细胞相同时,下室加入来源于TIP30-/-基因型小鼠的肝组织匀浆液较来源于TIP30+广基因型小鼠的肝组织匀浆液巨噬细胞迁移数少(P=0.01)；当下室加入的趋化因子相同时,TIP30基因沉默组RAW264.7较NC组巨噬细胞迁移数量少(P0.05)。结论：结合前期实验结果,TIP30基因敲除小鼠在DEN诱导下肝肿瘤发生率降低可能是因为：1.TIP30基因下调导致巨噬细胞内ERa上调,进而下调NFκB的磷酸化,导致IL-6分泌减少,使肝细胞STAT3活化减少,进而抑制肝细胞的分化、增殖。2.TIP30基因下调后使其结合的单核细胞趋化因子-1(MCP-1)也下调,与此同时,巨噬细胞本身迁移浸润能力降低,二者共同降低巨噬细胞趋化能力,使肝组织中巨噬细胞浸润降低,抑制慢性炎症反应及其相关的肝纤维化,导致肝癌发生率的降低。
【关键词】：TIP30基因 肝细胞癌 巨噬细胞 NFκB 白细胞介素-6
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-34
• 第一章 TIP30对巨噬细胞NFKB/IL-6的调节作用34-55
• 第一节 实验材料和方法34-47
• 第二节 实验结果47-52
• 第三节 讨论52-55
• 第二章 TIP30调控巨噬细胞迁移浸润的分子机制研究55-75
• 第一节 实验材料和方法55-66
• 第二节 实验结果66-73
• 第三节 讨论73-75
• 全文总结75-77
• 参考文献77-83
• 缩写词表83-84
• 致谢84-85
• 成果85-86

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