Bufalin对食管癌中FAK活化和上皮间质转化的影响

发布时间：2017-08-16 16:38

  本文关键词：Bufalin对食管癌中FAK活化和上皮间质转化的影响

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【摘要】：食管癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,早期的转移及侵袭是食管癌高死亡率的主要原因。黏着斑激酶(FAK),是一个125 k D的非受体型酪氨酸激酶,多项研究中均证实,FAK在食管癌的发生发展中扮演着重要的角色。近年来,FAK在肿瘤干细胞与肿瘤微环境以及上皮间质转化(EMT)中的作用逐渐成为研究的热点。上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞受到细胞外因子刺激后向间质细胞转化的过程,细胞间连接减少,同时与细胞周围基质粘连减少,细胞骨架重构,细胞运动能力增加。蟾蜍灵(Bufalin)是从传统中药蟾酥中提取的具有抗肿瘤作用的洋地黄类物质。但是Bufalin在食管癌中的具体作用机制仍然不明确。本实验室前期对Bufalin在食管癌中Ras/Raf/MEK/ERK信号转导通路中的作用作了大量实验研究,发现Bufalin可以通过下调ERK的磷酸化水平,发挥抗肿瘤作用。为了更好的了解食管癌发生发展的具体机制,本实验通过体内体外实验,研究了Bufalin对食管癌中FAK活化和上皮间质转化的影响,从而进一步探讨Bufalin在食管癌中抗肿瘤的作用机制。目的:探讨Bufalin对食管癌中FAK活化和上皮间质转化的影响。方法:1 RT-PCR方法检测不同浓度Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞FAK、E-Cadherin、Vim m RNA表达的影响。2 Western Blot方法检测不同浓度Bufalin对ECA109细胞FAK活化水平及FAK、E-Cadherin、Vim蛋白表达的影响。3采用划痕愈合和Transwell小室实验检测不同浓度Bufalin对ECA 109细胞迁移与侵袭能力的影响。4建立36只人食管鳞状细胞癌ECA109细胞裸鼠原位移植瘤模型,随机分为6组,即模型组、Bufalin低剂量组(0.5mg/kg,BL)、Bufalin中剂量组(1mg/kg,BM)、Bufalin高剂量组(1.5mg/kg,BH)、PF562271组(FAK抑制剂)、高剂量Bufalin与PF562271组联合应用组(BP),持续腹腔注射药物30天。用药期间观察裸鼠饮食和精神状态变化,记录裸鼠体重和肿瘤大小数据。5用药结束后处死全部裸鼠,测量肿瘤大小并计算肿瘤抑制率。6 HE染色检测各组裸鼠移植瘤肿瘤组织镜下表现。7 Real time-PCR检测各组裸鼠移植瘤中FAK、E-Cadherin、Vim m RNA的表达。8免疫组化法检测各组裸鼠移植瘤中FAK活化水平及FAK、E-Cadherin、Vim蛋白的表达。结果:1 Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞FAK表达及活化水平的影响RT-PCR结果表明Bufalin抑制FAK m RNA的表达。阳性对照组,20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271组,FAK m RNA的相对表达量分别为1.276±0.046,1.154±0.027,0.619±0.026,0.556±0.0172,0.439±0.022,0.221±0.0206,0.210±0.0285,与阳性对照组相比,药物干预组FAK相对表达量逐渐减少,差异具有统计学意义(P0.05)。Western Blot结果表明Bufalin抑制FAK的活化。阳性对照组,20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271组,FAK的相对表达量分别为1.255±0.111,1.357±0.050,1.177±0.065,1.278±0.099,1.239±0.196,1.199±0.106,1.188±0.094,药物干预组与阳性对照组相比,差异无统计学意义(P0.05);FAK活化水平的相对表达量分别为1.315±0.020,1.159±0.058,1.002±0.069,0.773±0.027,0.589±0.027,0.410±0.026,0.379±0.044,与阳性对照组相比,药物干预组FAK活化水平的相对表达量逐渐减少,差异具有统计学意义(P0.05)。2 Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞EMT的影响RT-PCR结果表明Bufalin增加E-Cadherin m RNA的表达,降低Vim m RNA的表达。阳性对照组,20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271组,E-Cadherin m RNA的相对表达量分别为0.231±0.016,0.435±0.048,0.568±0.034,0.669±0.025,0.842±0.031,0.939±0.036,0.948±0.027,与阳性对照组相比,药物干预组相对表达量逐渐增加,差异具有统计学意义(P0.05);Vim m RNA的相对表达量分别为0.852±0.051,0.682±0.025,0.567±0.034,0.431±0.047,0.300±0.016,0.212±0.024,0.190±0.022,与阳性对照组相比,药物干预组的相对表达量逐渐减少,差异具有统计学意义(P0.05)。Western Blot结果表明Bufalin增加E-Cadherin蛋白的表达,降低Vim蛋白的表达。阳性对照组,20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271组,E-Cadherin的相对表达量分别为0.351±0.009,0.459±0.006,0.515±0.006,0.619±0.006,0.756±0.005,0.859±0.007,0.867±0.005,相对表达量逐渐增加,差异均有统计学意义(P0.05);Vim蛋白的相对表达量分别为1.257±0.043,1.150±0.038,0.854±0.032,0.754±0.025,0.621±0.028,0.552±0.034,0.539±0.040,相对表达量逐渐减少,差异均有统计学意义(P0.05)。3 Bufalin对食管鳞状细胞癌ECA109细胞迁移及侵袭能力的影响实验结果表明Bufalin可以抑制ECA109细胞的迁移及侵袭。药物干预组(20,40,60,80,100 nmol/L Bufalin及PF562271组)与阳性对照组相比较,划痕实验结果显示细胞划痕距离由1.156±0.118增加至1.556±0.249,2.981±0.167,3.685±0.121,4.614±0.170,5.316±0.104,5.795±0.178;Transwell迁移实验结果显示穿过基底膜的细胞个数由107.00±8.19下降至78.67±3.06,61.67±3.06,42.67±3.512,24.33±2.517,10.33±3.215,9.00±2.65;Transwell侵袭实验结果显示穿过基底膜的细胞个数由127.67±8.02下降至102.33±4.51,87.33±7.10,73.00±4.58,57.33±2.52,39.00±3.61,37.33±2.52,差异均有统计学意义(P0.05)。4裸鼠移植瘤实验中模型组、BL组、BM组、BH组、PF562271组、BP组裸鼠饮食及精神状态未见异常;用药前后各组裸鼠体重差异无统计学意义(P0.05)。5 Bufalin对裸鼠食管鳞状细胞癌移植瘤生长的影响模型组、BL组、BM组、BH组、PF562271组、BP组裸鼠肿瘤体积分别为2.430±0.052cm3,2.378±0.042cm3,1.805±0.052cm3,1.722±0.072cm3,1.703±0.062cm3,1.128±0.064cm3肿瘤体积逐渐减小,与模型组相比,BM组、BH组、PF562271组、BP组,差异均有统计学意义(P0.05)。各用药组的肿瘤抑制率分别为4.4%,45.6%,63.5%,65.2%,71.1%。6各组裸鼠原位移植瘤瘤组织HE染色镜下特点各组裸鼠原位移植瘤瘤组织HE染色切片,均呈低分化鳞状细胞癌的特点,癌细胞异形性明显,细胞形态多样,排列成大小不等的实性巢,核大深染,核染色质呈粗颗粒状,核仁明显,少见细胞间桥及角化。7 Bufalin对裸鼠食管鳞状细胞癌原位移植瘤中FAK表达、活化水平及EMT的影响Real time-PCR结果表明Bufalin可以降低FAK的表达,增加E-Cadherin的表达,降低Vim的表达。BL组、BM组、BH组、PF562271组、BP组,各组FAK m RNA的相对表达量逐渐降低,分别为0.956±0.015,0.677±0.041,0.516±0.019,0.480±0.015,0.343±0.022;各组E-Cadherin m RNA的相对表达量逐渐增加,分别为1.137±0.140,1.840±0.095,2.593±30.127,2.600±0.151,3.245±0.100;各组Vim m RNA的相对表达量逐渐降低,分别为1.004±0.033,0.791±0.027,0.540±0.026,0.501±0.015,0.399±0.023,与模型组相比,BM组、BH组、PF562271组、BP组,差异均有统计学意义(P0.05)。免疫组化结果表明Bufalin可以降低FAK的表达及活化,增加E-Cadherin的表达,降低Vim的表达。模型组、BL组、BM组、BH组、PF562271组、BP组免疫组化结果:FAK免疫反应积分平均秩次分别为49.20,46.70,36.35,24.60,20.10,6.05,FAK蛋白表达逐渐降低;FAK活化水平各组免疫反应积分平均秩次分别为46.90,40.50,31.15,26.00,22.80,15.65,FAK活化水平逐渐降低;E-Cadherin免疫反应积分平均秩次分别为8.75,14.00,24.40,40.60,42.5,52.75,E-Cadherin蛋白表达逐渐增加;Vim免疫反应积分平均秩次分别为51.00,47.90,36.40,21.10,20.20,6.40,Vim蛋白表达逐渐降低,与模型组相比,BM组、BH组、PF562271组、BP组,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:1 Bufalin可以抑制ECA109细胞的迁移及侵袭。2 Bufalin可以抑制裸鼠食管鳞状细胞癌移植瘤的生长。3 Bufalin可以抑制食管鳞状细胞癌中FAK的活化,提示Bufalin可能是通过下调FAK来抑制食管鳞状细胞癌上皮间质转化过程。
【关键词】：上皮细胞间质转化 黏着斑激酶 Bufalin 食管鳞状细胞癌 ECA109 裸鼠移植瘤
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.1
【目录】：

• 中文摘要4-9
• 英文摘要9-15
• 英文缩写15-16
• 前言16-17
• 材料与方法17-31
• 结果31-35
• 附图35-45
• 附表45-51
• 讨论51-53
• 结论53
• 参考文献53-57
• 综述 黏着斑激酶与肿瘤的研究进展57-68
• 参考文献62-68
• 致谢68-69
• 个人简历69

【参考文献】

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1 张学彦;吕成倩;杜冰;马骁;关景明;高善玲;杨甜;常圆;;FAK在食管癌组织中的表达及临床意义[J];胃肠病学和肝病学杂志;2014年08期

2 田昕;罗颖;闫永波;隋承光;孟凡东;刘云鹏;;蟾蜍灵对人食管鳞癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响[J];中国医学科学院学报;2012年06期

3 黄玉钿;张声;;粘着斑激酶在乳腺癌的表达及其与血管生成的关系[J];南方医科大学学报;2007年09期

4 韩景田;蟾蜍灵的药理活性研究进展[J];中国药物与临床;2002年02期

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本文编号：684378