草酰乙酸的肝癌细胞HepG2毒性及上调HepG2细胞VEGF mRNA表达的研究

发布时间：2017-08-17 13:15

  本文关键词：草酰乙酸的肝癌细胞HepG2毒性及上调HepG2细胞VEGF mRNA表达的研究

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【摘要】：草酰乙酸是三羧酸循环的重要中间代谢产物之一，除了作为底物参与能量代谢外还具有许多其他的生物学功能。本研究中首次发现草酰乙酸对人肝癌细胞系HepG2呈现出选择性的细胞毒性作用，并且证明该细胞毒性作用与细胞凋亡和活性氧堆积有关。首先，75mM草酰乙酸能够降低HepG2细胞活力，减少细胞克隆形成能力，引起细胞死亡。其次，75mM草酰乙酸能够引起HepG2细胞内促凋亡基因Bax的mRNA水平上调，抗凋亡基因Bcl-2的mRNA水平下调，表明草酰乙酸引起的细胞死亡与内源性凋亡途径有关。此外，75mM草酰乙酸处理过的细胞内活性氧水平升高，加入抗氧化剂NAC和GSH后，细胞内活性氧含量和细胞死亡情况都得到缓解。但是，，抗氧化剂不能缓解草酰乙酸引起的细胞凋亡，表明草酰乙酸诱导的细胞死亡至少包括细胞凋亡和活性氧堆积两条通路。 除了草酰乙酸的选择性肝癌细胞毒性外，我们还首次发现20mM草酰乙酸可以激活ERK/Hif-1α/VEGF通路，具有潜在的促进血管生成作用。首先，20mM草酰乙酸能增强HepG2细胞中ERK的磷酸化。ERK蛋白磷酸化导致其下游蛋白Hif-1α稳定性增强，并使受Hif-1α调控的血管内皮生长因子VEGF的mRNA表达水平增强。当加入MEK1阻断剂PD98059后，ERK蛋白磷酸化受到抑制，Hif-1α蛋白表达相应降低，VEGF的mRNA水平也随之降低。已知VEGF的表达与血管生成密切相关，因此我们初步推测草酰乙酸可能通过ERK/Hif-1α/VEGF途径，具有潜在的促血管生成的作用。
【关键词】：草酰乙酸 肿瘤代谢 血管生成 细胞毒性 肝癌
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-7
• 中英文缩略词表7-11
• 第1章 绪论11-22
• 1.1 草酰乙酸及其生物学作用11-14
• 1.2 草酰乙酸生物学作用研究的意义14-16
• 1.3 细胞凋亡、活性氧与肿瘤16-19
• 1.3.1 细胞凋亡与肿瘤16-18
• 1.3.2 活性氧与肿瘤18-19
• 1.3.3 肿瘤细胞凋亡与活性氧19
• 1.4 肿瘤血管生成19-22
• 第2章 草酰乙酸肝癌 HepG2 细胞毒性作用的研究22-42
• 2.1 实验仪器和材料22-26
• 2.1.1 主要仪器22-23
• 2.1.2 主要试剂和耗材23-25
• 2.1.3 主要试剂配制25-26
• 2.1.4 细胞株来源26
• 2.2 实验方法26-32
• 2.2.1 细胞培养26-27
• 2.2.2 MTT 法检测细胞活力27
• 2.2.3 光镜下观察细胞形态27
• 2.2.4 克隆形成实验检测细胞存活27-28
• 2.2.5 流式细胞术检测细胞死亡28
• 2.2.6 RNA 提取28-29
• 2.2.7 RNA 定量29
• 2.2.8 逆转录反应29
• 2.2.9 PCR 反应29-30
• 2.2.10 琼脂糖凝胶电泳30-31
• 2.2.11 Caspase3 酶活力测定31-32
• 2.2.12 细胞 ROS 水平检测32
• 2.3 数据处理32
• 2.4 实验结果32-40
• 2.4.1 草酰乙酸选择性诱导人肝癌细胞 HepG2 死亡32-35
• 2.4.2 草酰乙酸诱导的肝癌 HepG2 细胞死亡和凋亡有关35-36
• 2.4.3 草酰乙酸诱导的细胞死亡和活性氧有关36-40
• 2.5 讨论40-42
• 第3章 草酰乙酸上调肝癌 HepG2 细胞 VEGF mRNA 表达的研究42-53
• 3.1 实验仪器和材料42
• 3.2 实验方法42-45
• 3.2.1 Western Blot 法检测相关蛋白表达42-45
• 3.3 数据处理45
• 3.4 实验结果45-51
• 3.4.1 草酰乙酸使 ERK 磷酸化程度增高45-46
• 3.4.2 草酰乙酸通过 ERK 的磷酸化稳定细胞 Hif-1α蛋白水平46-49
• 3.4.3 草酰乙酸能上调血管内皮生长因子 VEGF 的 mRNA 表达49-50
• 3.4.4 MEK1 阻断剂能阻断草酰乙酸诱导的血管内皮生成因子VEGF 表达上调50-51
• 3.5 讨论51-53
• 第4章 结论53-54
• 参考文献54-62
• 在学期间获得的研究成果62-63
• 致谢63

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 ;活性氧对细胞增殖、凋亡及损伤作用的剂量-效应关系研究[J];癌变.畸变.突变;2001年04期

2 曹纯章,杨绍娟,卜丽莎,杨同书;过氧化氢诱导心肌细胞凋亡性和非凋亡性死亡的研究[J];中国病理生理杂志;2000年05期

3 ;Inactivation of PTEN is associated with increased angiogenesis and VEGF overexpression in gastric cancer[J];World Journal of Gastroenterology;2004年21期

本文编号：689187